原始淋巴管网络重塑形成收集淋巴管的分子机制研究

It is still poorly understood about the mechanism underlying the lymphatic remodeling to form collecting vessels. Receptor tyrosine kinase Tie2 plays a crucial role in the regulation of blood vascular maturation. We have found in the previous study that Tie1 is involved in the regulation of collecting lymphatic formation. To investigate the role of angiopoietin-2 (Angpt2) and Tie2 pathway in lymphatic development and whether Tie1 functions via Tie2 in this process, we have generated conditional knockout mouse models targeting Angpt2 (Angpt2Flox) and Tie2 (Tie2Flox). We will generate doubly genetic models by mating the Floxed mice with Prox1-CreERT2 transgenic mice with Cre expression in lymphatic endothelial cells, and analyse lymphatic phenotypes after Angpt2 and Tie2 deletion induced by tamoxifen treatment. In addition, it has been shown that fluid shear stress plays important roles in blood vascular development. We will isolate primary lymphatic endothelial cells (LEC) from wildtype and genetically modified mouse models and study the effect of shear stress on LEC gene expression and Tie2 mediated signaling pathway before and after gene deletion. This study will help elucidate the molecular pathways in the regulation of lymphatic remodeling and maturation, and provide experimental evidence for understanding the causes of lymphatic diseases.

目前对收集淋巴管生成与重塑的调控机制还了解很少。受体酪氨酸激酶Tie2是调控血管成熟的关键基因，我们的前期研究表明Tie1参与调控收集淋巴管形成，为阐述血管生成素-2（Angpt2）/Tie2信号途径在淋巴管发育中的作用及Tie1是否通过Tie2发挥作用，我们建立了Angpt2条件性基因敲除小鼠(Angpt2-Flox)及Tie2-Flox小鼠模型，通过与淋巴管内皮细胞表达Cre的转基因小鼠(Prox1-CreERT2)交配，制备双重遗传改造小鼠模型，利用三苯氧胺处理诱导基因敲除，分析Tie2介导的信号缺失对收集淋巴管发育与维持的影响与作用机制。液体剪切力在循环系统发育重塑中起重要作用，我们将分离原代淋巴管内皮细胞，并诱导基因敲除，比较分析液体剪切力对野生型与突变体淋巴管内皮细胞基因表达及Tie2下游信号的影响。此研究有助于阐述淋巴管成熟的分子调控，为研究相关疾病的发生机制提供实验依据。

目前对集合淋巴管生成与重塑的调控机制还了解很少。本项目利用靶向受体酪氨酸激酶Tie1、Tie2及其配体血管生成素-2（Angpt2）的条件性基因敲除小鼠开展淋巴管研究，主要结果包括：1）利用靶向Tie1胞内域的条件性基因敲除小鼠，分析了胚胎发育期敲除Tie1基因（Tie1△ICD/△ICD）对淋巴管与血管形成的影响。研究发现，Tie1缺失导致初始淋巴管连接异常并伴有皮下水肿（E13.5），但不影响淋巴管内皮细胞的增生与淋巴管管腔形成；而且对早期血管生长也没有明显的影响(E10.5)。原始淋巴管网络约在E15.5左右起重塑形成集合淋巴管，此过程在Tie1缺失的小鼠受阻；在胚胎发育后期皮肤与肠系膜淋巴管分析结果进一步证实，敲除Tie1基因导致集合淋巴管与瓣膜形成缺陷。在此研究基础上，我们分析了Tie1在出生后小鼠淋巴管生成与成熟重塑中的作用，在新生小鼠利用三苯氧胺诱导敲除Tie1基因导致皮肤淋巴管形态与功能异常；并发现敲除Tie1基因导致耳皮肤前集合淋巴管瓣膜数量显著减少，集合淋巴管瓣膜可检测到，但异常表达毛细胞淋巴管标志物LYVE1。利用Ang2基因条件性基因敲除小鼠进行的研究表明，胚胎发育阶段敲除Ang2基因对初级淋巴管网络形成没有明显影响，但毛细淋巴管管径变细、以及淋巴管内皮细胞的数量显著下降；而且集合淋巴管及瓣膜生成异常。由于Ang2不能直接结合Tie1，为分析Ang2与Tie1是否通过Tie2起作用，本项目也制备了靶向Tie2条件性基因敲除小鼠,并系统分析了出生后小鼠敲除Tie2对其淋巴管生成与重塑的影响。研究发现，相对于主静脉内皮细胞，Tie2在淋巴囊内皮细胞呈低水平表达。在新生小鼠利用三苯氧胺诱导敲除Tie2基因，不影响皮肤淋巴管生长、集合淋巴管形成与瓣膜发育。为进一步研究Tie2是否在胚胎期淋巴管发育中起作用，我们利用在内皮细胞表达Cre重组酶的转基因小鼠制备双转基因小鼠（Tie2Flox/-;Cdh5-CreERT2），胚胎发育中期（E10.5-E12.5）诱导敲除Tie2导致皮肤初始淋巴管管径变粗。该研究结果提示了TIE信号途径在淋巴管生长、重塑与瓣膜形成中的重要作用，为阐明淋巴管发育调控及相关疾病的病理机制提供了重要依据。