负载VHH抗体的乳酸杆菌防治轮状病毒腹泻的实验研究

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻最常见的原因，危害严重。目前，尚缺乏有效的防治手段。口服轮状病毒疫苗是一种有效且简便易行的预防方法，但其存在一些缺陷：如引起婴儿较强烈的副反应、保护周期短、效果不理想等。已有研究表明，采用被动免疫疗法可以防治轮状病毒腹泻，这种途径可以克服口服轮状病毒疫苗的一些缺陷。VHH抗体是源自骆驼和羊驼的一种只有重链的抗体，它具有很多独特的优势，尤其具有很强的耐酸、耐碱和耐热性，即使口服也能在胃肠道内保持较好的活性，提示VHH抗体在胃肠道感染性疾病被动免疫治疗方面有潜在的应用价值。本项目拟以轮状病毒免疫羊驼，构建抗轮状病毒VHH噬菌体抗体库，从中筛选具有病毒中和活性的抗体，将其转化入乳酸杆菌，使其能在乳酸杆菌表面组成性和分泌性表达VHH抗体，在小鼠模型上观察口服负载VHH抗体的乳酸杆菌防治轮状病毒腹泻的效果并探讨其机理，探索一种通过被动免疫疗法预防和治疗轮状病毒腹泻的新方法。

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻最常见的原因，危害严重。目前，尚缺乏有效的防治手段。口服轮状病毒疫苗是一种有效且简便易行的预防方法，但其存在一些缺陷：如引起婴儿较强烈的副反应、保护周期短、效果不理想等。已有研究表明，采用被动免疫疗法可以防治轮状病毒腹泻，这种途径可以克服口服轮状病毒疫苗的一些缺陷。VHH抗体是源自骆驼和羊驼的一种只有重链的抗体，它具有很多独特的优势，尤其具有很强的耐酸、耐碱和耐热性，即使口服也能在胃肠道内保持较好的活性，提示VHH抗体在胃肠道感染性疾病被动免疫治疗方面有潜在的应用价值。本项目以牛轮状病毒免疫羊驼，构建抗轮状病毒VHH噬菌体抗体库，从中筛选具有最优病毒中和活性的VHH1抗体，构建分泌型VHH1重组质粒（pTRKH2-PsT/sVHH1）和膜表达型VHH1重组质粒（pTRKH2-PsT/aVHH1），并将构建的重组质粒分别电穿孔转化入乳酸杆菌。酶联免疫（ELISA）法显示重组的乳酸杆菌可产生一定量的膜表达型或分泌型VHH1片段。扫描电镜等显示轮状病毒颗粒可结合于膜表达型VHH1乳酸杆菌表面。抗体中和能力的测定结果显示膜表达型或分泌型VHH1片段均能产生明显的病毒中和作用。采用口服灌胃牛轮状病毒培养液可成功复制出昆明小鼠腹泻模型，通过观测腹泻严重性、持续性、小肠病毒负荷及肠道形态学等指标分析判断负载膜表达型或分泌型VHH1的重组乳酸杆菌预防或治疗小鼠轮状病毒腹泻的效果。结果显示：口服负载膜表达型VHH1的乳酸杆菌可显著减少轮状病毒感染引起的小鼠腹泻模型的发病持续时间、严重程度和肠道病毒量等，具有明显的预防或治疗效果。其作用机制与维持肠道菌群稳态，抑制NF-κB活化，减少炎症介质等释放有关。口服负载膜表达型VHH1的重组乳酸杆菌可能成为一种新的防治轮状病毒感染方法。