PI3K-Akt-mTORC2局部通路在血小板活化中的调控作用及机制探讨

Platelet activation is a critical step of arterial thromboembolism. There are a series of regulatory internal signal transduction driven platelet activation. Platelet transmembrane signaling PI3K/Akt pathway plays an important role in platelet activation and arterial thrombosis formation. Recently, a studiy has shown that one of PI3K/Akt pathway downstream complexes, serine/threonine protein kinase PIKK family mTORC1, regulates the Rac1 activity-mediated collagen-induced platelet activation through S6K1. But the function of PI3K/Akt another important downstream complexes-mTORC2 was not investigated in platelet activation and thrombosis formation. Our previous work has found that key components of mTORC2 complex such as Rictor and SIN1, highly expressed in both human and mouse platelets. And the Akt Ser473 phosphorylation regulated by the mTORC2 complex correlated with agonists-induced platelet activation. Therefore, we proposed that the PI3K-Akt-mTORC2 pathway may play an important role platelet activation and arterial thrombosis formation. The project presented here will study the function and mechanism of the PI3K-Akt-mTORC2 pathway in platelet activation using platelet-specific gene knock mice and pharmacological inhibitors. This study helps to clarify the mechanism of arterial thrombosis formation, and develop new antithrombotic drugs for treatment of arterial thrombotic diseases.

血小板活化是动脉血栓形成关键步骤，其内部一系列的信号转导调控机制参与活化过程。已明确血小板的跨膜信号PI3K/Akt通路在血小板活化中有重要作用。最新研究表明PI3K/Akt下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PIKK家族mTORC1复合物通过S6K1调控Rac1的活性介导胶原引起的血小板活化，但是PI3K/Akt下游另一mTORC2复合物在血小板活化和血栓形成中的作用尚无任何研究。我们的前期工作发现人和小鼠血小板中都高表达mTORC2复合物的关键组成分子Rictor和SIN1，而且受mTORC2复合物调控的Akt Ser473磷酸化与血小板活化呈正相关。因而，我们推断PI3K-Akt-mTORC2通路在血小板活化过程中发挥重要功能。本项目将围绕这一发现，利用血小板特异基因敲除小鼠和小分子抑制剂对PI3K-Akt-mTORC2通路在血小板活化中的作用及其机制展开研究；对阐明动脉血栓机制有重要意义。

本课题按基金任务书要求系统研究了PI3K-Akt-mTORC2通路对血小板的活化作用及探讨机制。在课题研究中我们采用了3种主要的动物模型及2种细胞模型：1.3种动物模型为血小板特异 PDK1、Sin1和 PTEN 基因敲除小鼠。通过在体研究三种小鼠颈动脉血栓模型及体外血小板聚集、铺展、栓块收缩等血小板活化指标，探讨PI3K-Akt-mTORC2通路在血小板活化中的作用。2.2种细胞模型为高表达整合素αIIbβ3及ERK5的中国仓鼠细胞及人肾脏细胞系。利用该细胞模型及MAPK其它特异性抑制剂研究MAPK通路与PI3K-Akt通路的相互调节机制。课题的主要结果为：1、PTEN基因敲除显著促进Akt Ser473位点磷酸化，并促进血小板分泌、聚集，该作用部分被PI3K抑制剂所抑制；2、PDK1基因敲除主要影响Akt Thr308位点磷酸化，进而影响Gsk3β Ser9磷酸化水平，PDK1基因敲除后血小板活性减弱，颈动脉血栓形成时间延长；3、MAPK激酶抑制剂对血小板的聚集均有较明显的抑制作用，并对Akt Ser473及Thr308位点呈现浓度依赖性抑制作用。其中，ERK5抑制剂对栓块收缩、血小板铺展均有较显著的影响，我们通过在CHO及293T细胞系中高表达ERK5，采用免疫共沉淀及质谱分析的方法，发现ERK5可通过与CKII结合，调节PTEN Ser370磷酸化水平，进一步影响到Akt磷酸化水平，从而调节血小板活性。4、mTORC2复合物成分Sin1的敲除可影响到血小板的聚集，铺展，其作用机制及在体血栓及心梗模型尚需进一步研究总结。课题研究证明：PI3K-Akt-mTORC2通路在血小板活化中扮演重要角色，PTEN通过将磷酯酰肌醇3(PtdIns(3,4,5)P3)去磷酸化，负向调控该通路；ERK5可下调PTEN活性，促进该通路激活。针对该通路关键激酶的调控有望为将来抗栓研究提供新的靶点。课题调整情况：由于时间限制，针对血小板特异Sin1基因敲除小鼠模型的工作尚需进一步研究总结。课题已培养博士研究生2名、硕士研究生1名。公开发表论文2篇（其中SCI1篇）,待发表论文3篇，其它的结果在进一步整理中。在此基础上，课题组新申请到2016年上海市科委项目一项，编号为16411965600。