应用分子超声成像探讨活化血小板在动脉粥样硬化病程中的作用机制

Recently, many studies indicated that during the course of atherosclerosis,platelets not only play a role in thrombosis,also contribute to the initiation and progression of atherosclerosis as an inflammatory mediator. In our previous studies with mice model of atherosclerosis, we found there was a small quantity of platelets adhesion to the endothlium without plaque formation in the early stage of atherosclerosis. In addtion, platelets adhesion to the endothelium increased with the progresion of AS inflammation. Threrefore, we presumed that platelets adhesion to the endothelium is critical to the initiation of atherosclerosis lesion. And this interaction of platelets and endothelium may in turn lead to the development and progeression of atherosclerosis by recruiting monocytes from flowing blood and enhancing monocytes adhesion and transmigation. Based on previous studies and our hypothesis, this study will be performed in the following steps, 1) preparing contrast microbubbles targeted to platelets and inflammatory molecules on the endothelium,which will be used as molecular probes in vivo experiment; 2) molecular imaging of the platelets and inflammatory molecules on the endothelium in all stages of atherosclerosis; 3) combined with histology analysis, assessing the pathogenetic role of the platelets in procession of atherosclerosis by disruption of the platelets-endothelium interactoin. The aim of this study is to elucidate the dysregulated platelets-endothelial interaction could be an importand pathogenic mechanism in the development of atherosclerosis.

近年的研究表明，动脉粥样硬化病变（Atherosclerosis, AS）的进程中，血小板不单纯具有促血栓形成作用，而且作为一种重要的炎性介质调控着AS病变的发生与发展。我们在AS小鼠模型的研究中发现：在病变早期尚无斑块形成阶段，即可见少量的血小板黏附于血管内皮表面；而且血小板与炎性细胞在病变部位的分布具有一定重叠性。由此我们推测：血小板作为一种炎性介质，其与血管内皮的黏附作用是AS病变重要始动因素，而这种作用很可能通过调控单核白细胞的聚集与浸润而影响AS炎性病变的进展。基于我们前期的研究发现与假设，本研究拟将构建新型的针对血小板与血管内皮表面炎性标志物的靶向微气泡作为分子探针，采用分子超声成像技术在活体内动态观察血小板对血管内皮黏附作用与AS炎症病程的关系，结合组织病理学分析观测血小板-血管内皮作用阻断后AS炎性病变的进展，深入阐明血小板在AS炎性病变的起始与进展过程中的作用机制。

动脉粥样硬化病变的进程中，血小板不单纯具有促血栓形成作用，而且很可能作为一种重要的炎性介质调控AS病变的发生与发展。本研究采用生物素-亲和素桥接的方法成功构建携带小分子多肽vWF-A1功能域的血小板靶向微气泡造影剂，在体外平行板灌注腔实验观察其在血流动力学条件下对活化血小板的特异性识别与结合作用，随后在建立反映动脉粥样硬化不同病变阶段（8W、16W、24W、32W）的ApoE基因敲除小鼠模型基础上，采用分子超声造影成像在活体动物体内同时分析中血小板对血管内皮的黏附作用以及血管内皮表面炎性粘附分子VCAM-1的表达，结合超高频超声成像以及组织病理学技术的综合评估观察，探讨血小板对血管内皮的黏附作用与血管内皮表面黏附分子的表达水平、炎性细胞的浸润以及斑块进展之间的关系。我们的研究结果表明：1）成功构建携带小分子多肽vWF-A1功能域的血小板靶向微气泡造影剂，平行板灌注腔实验中证实不同剪切应力条件下携vWF-A1功能域微气泡对活化血小板的特异性识别、粘附作用，而且靶向微气泡的特异性粘附作用在一定的剪切力范围内（2-8dynes/cm2）不随流体剪切应力在增高而减低，为进一步的活体实验研究奠定基础；2）采用高脂饮食喂养Apo E基因敲除小鼠的方法能够建立反映动脉粥样硬化病变进展过程的动物模型，采用高分辨率超声（30MHz）测量主动脉弓及无名动脉起始段管壁厚度，小鼠的血脂以及主动脉斑块比例分析（H&E染色）均表明动脉粥样硬化病变随着周龄的增加呈现进行性增长；3）分子超声成像过程中，8周龄ApoE（-/-）小鼠即可在主动脉内成功检测到特异性粘附的携vWF-A1功能域血小板靶向微气泡，这种特异性微气泡的信号强度随着周龄的增长呈进行性上升趋势；ApoE（-/-）小鼠中，来自血小板靶向微气泡的信号强度与反应主动脉炎性表达的VCAM-1靶向微气泡信号强度以及免疫组织化学染色中反应主动脉单核炎性细胞浸润程度的MAC-2染色分析具有一致性的增长趋势；30周龄ApoE（-/-）小鼠中，血小板阻滞后，血小板靶向微气泡信号强度显著减低，但封闭P-selectin,血小板靶向微气泡信号强度仅可见中等程度的减低。我们的研究为活体内检测活化血小板提供新的方法和途径，而且，活体动物体内的连续性动态分析也为进一步明确了血小板对血管内皮的黏附作用是动脉粥样硬化炎症病程起始与进展中的重要炎性作用机制之一。