脉冲强光致产毒黄曲霉菌细胞凋亡的光热效应发生机制研究

Aspergillus flavus has become one of the most harmful microorganisms because its secondary metabolites aflatoxin has strong toxicity and carcinogenicity.Therefore, exploring the methods of Aspergillus flavus and their spore’s inactivation and aflatoxin degradation has became the hotspot of the international academia. Recent studies have found that pulsed light (PL) as an emerging technology has high efficient effects on Aspergillus flavus sterilization. However, studies related on the mechanisms of the sterilization were rarely reported. Especially, there is no unified conclusion on the mechanisms of the photo-thermal effect. In this project, a scientific and accurate quantitative technology of flow cytometry will be used to investigate the cell activity caused by PL. The photo-thermal effect on regulation the toxin producing ability will be studied systematically by using HPLC. The behavior of flowability and permeability of membrane will be conducted with DPH fluorescence probe method and PI fluorescence probe method respectively to investigate the effects and mechanisms of photo-thermal effect on cell membrane at cell level. FTIR spectroscopy will be applied to study the secondary structure of proteins in membrane and in cells to reveal the influence of photo-thermal effect on the proteins. Proteomic method will be used to explore the mechanism of light caused apoptosis at molecular level. This project has potential value in solving scientific problems for designing of high intensity PL sterilization device and application in related fields.

黄曲霉菌因其次级代谢产物黄曲霉毒素具有很强的毒性和致癌性成为最具危害的病源微生物之一，因此探讨黄曲霉菌及其孢子的杀灭及黄曲霉毒素降解的方法成为国际学术界的热点。近年研究发现，脉冲强光（PL）作为一种新兴的高效杀菌技术对黄曲霉具有显著的杀灭作用，但有关PL杀菌的基础理论研究还非常薄弱，尤其是光热效应的作用机制尚无统一结论。本项目基于科学定量的流式细胞仪及高效液相色谱的精确检测技术，系统地研究受PL照射黄曲霉活性及光热效应对其产毒能力的调控；借助DPH荧光探针法和PI探针法研究其细胞膜的流动性和通透性，从细胞水平探讨PL光热效应破坏细胞膜的作用机制；利用傅里叶变换红外光谱技术研究细胞膜上蛋白及胞内蛋白二级结构的改变；采用蛋白质组学的方法研究黄曲霉应对极端强光代谢特性的变化，探索PL致黄曲霉细胞凋亡的分子机制。本项目科学问题的解决对于高强度PL杀菌方法的设计及在相关领域的应用具有潜在价值。

脉冲强光（PL）是一种新兴的非热杀菌技术，因其杀菌效率高、对环境无污染等优点，成为食品杀菌方面的重点研究对象。目前关于PL杀菌的研究主要集中在杀菌效果和工艺应用方面，对其杀菌机理研究不够深入，不利于科学杀菌方法的建立。.本项目以食源性致病菌Escherichia Coli（E. coli）为目标微生物，重点研究PL对微生物的灭活作用及其杀菌机理。主要包括介质及处理参数对E. coli的灭活效果的影响，用Linear和Weibull模型来拟合杀菌曲线，利用扫描电子显微镜对PL处理前后E. coli形态结构的影响，通过荧光染色研究细胞膜流动性、通透性的变化，以及PL处理前后E .coli蛋白组学的变化。从细胞水平和分子水平探讨了PL对微生物的灭活机理。.研究结果表明：（1）微生物因素（微生物的生长阶段）、介质因素（温度、pH、透光率）以及处理条件（脉冲强度、脉冲时间）等对脉冲强光灭活E. coli均有一定的影响。（2）Linear和Weibull模型都能较好地拟合脉冲强光对E. coli悬液的杀菌曲线，且Weibull模型较Linear模型更为精确。（3）扫描电镜观察到脉冲强光使E. coli表面发生变形，破坏了细胞膜结构，菌体表面出现萎缩、褶皱、穿孔等现象。（4）脉冲强光会造成E. coli细胞膜流动性下降、通透性增加。流动性和通透性作为细胞膜的主要特性，其改变会影响细胞膜生理功能的正常运行，这都有可能导致微生物死亡。（5）经过GO分析和KEGG pathway分析差异蛋白后发现，随着脉冲强光照射能量的增加，脉冲强光对E. coli生理学功能的破坏不断深入，破坏了细胞膜、胞内大分子复合物等区域蛋白，造成E. coli有机物代谢和能量代谢的能力下降，显著影响了E. coli的氨基苯甲酸降解、ABC转运机制、鞭毛组装、感应外界刺激及进行信号转导的能力，这也可能是E. coli死亡的深入原因。.本项目在细胞和分子水平上探讨PL杀菌效应发生的机制，对于今后更为科学的设计PL杀菌方法，进一步扩大高强度PL在其他领域应用具有潜在的应用价值。