脉冲强磁场作用下食源性致病菌细胞凋亡及其生物学窗效应发生机制研究

Relative to the other non-thermal sterilization technology, such as high hydrostatic pressure and pulsed electric field, the researches about high intensity pulsed magnetic field (PMF) in the international are scarce, especially on the bactericidal mechanism. The project will take two kinds of foodborne pathogens with different resistance Escherichia coli and Clostridium botulinum as the research objects; establish a scientific quantitative method on magnetic field dose; systematically study response of bacterial on PMF effect, occurrence of biological window effect and its distribution based on flow cytometric detection technology. Study the across membrane behavior of calcium ions with the aid of Fura-2/AM fluorescence probe method; observe the distribution of intracellular calcium ions with laser confocal scanning microscopy; on the cell level explore damage of cell membrane permeability, start of cell apoptosis and occurrence of window effect; comparative study occurrence of biological window effects from two index system of the calcium ion concentration and bacterial activity. Explore the molecular mechanism of the bacteria apoptosis caused by PMF with proteomic approach. Early studies of applicants have found many prototypes on window effect, and preliminarily studied on across-membrane behavior of calcium ions. Solving for scientific problems in this project has potential value on design of high intensity PMP sterilization method and its application in other fields. It is possible for giving new biological connotation to the concept on spacetime stereo concentration of calcium ion.

相对于超高压、脉冲电场等非热杀菌技术而言，高强度脉冲磁场（PMF）在国际上研究甚少，尤其是关于杀菌机制的探讨鲜见报道。本项目以大肠杆菌和肉毒梭状芽孢杆菌两种抗性不同的食源性致病菌为模式细菌，基于磁场剂量的科学定量和流式细胞仪精确检测技术，系统研究细菌对PMF作用的应答、生物学窗效应的发生及其分布规律；借助Fura-2/AM荧光探针法研究钙离子的跨膜行为，利用激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子的空间分布，从细胞水平探讨细胞膜通透性破坏、细胞凋亡启动及窗效应发生等科学问题，从钙离子浓度和细菌活性两个指标体系对比研究杀菌中生物学窗效应的发生；采取蛋白质组学的方法，探索磁致细菌凋亡的分子机制。申请者前期研究已经多次发现窗效应存在的雏形，并初步研究了其钙离子的跨膜行为。本项目所及科学问题的解决对于高强度PMP杀菌方法的设计及在其它领域的应用有潜在价值，有可能为钙离子时空立体浓度概念赋予新的生物学内涵。

大量的试验发现，脉冲强磁（PMP）对食源性致病菌具有显著的灭活效果，是一种有潜在应用前景的食品非热物理加工技术。但是目前对受脉冲强磁作用，微生物凋亡的根本原因和杀菌中出现的生物学窗效应的机理研究不够深入，不利于科学杀菌方法的建立。.以食源性致病菌B. Subtilis和L.grayi为杀菌对象，研究了磁致食源性致病菌细胞凋亡及发生生物学窗效应的机制。用Bigelow、Weibull、Hülsheger模型来拟合杀菌曲线。通过细胞膜的流动性、渗透性、Ca2+跨膜行为、细胞壁和细胞膜结构、蛋白质组学，研究磁致食源性致病菌细胞凋亡和生物学窗效应发生的机制。.研究结果发现：（1）发现Weibull模型很好地拟合了脉冲磁场作用下B. Subtilis和L.grayi菌的残留率曲线；（2）脉冲磁场造成B. Subtilis和L.grayi菌细胞膜流动性的下降、细胞膜渗透性的增加，细胞膜流动性的下降可能影响到B. Subtilis和L.grayi菌的生理学功能，渗透性的增加可能会造成细胞膜结构的破坏，这都可能导致细胞死亡；（3）经脉冲磁场处理后的细胞[Ca2+]i比未经脉冲磁场处理的细胞[Ca2+]i高，说明细胞膜的通透性增加，细胞[Ca2+]i的超载，可能是导致B. Subtilis和L.grayi细胞死亡和发生窗效应的原因之一；（4）脉冲磁场使B. Subtilis和L.grayi菌发生变形，核酸、蛋白等胞内物质从细胞内溢出，DNA断裂，并影响了胞内游离氨基酸产生；（5）经过KEGG pathway分析差异蛋白后发现，部分蛋白有pathway信息，部分蛋白参与了多种pathway，脉冲磁场会导致胞内能量代谢平衡、有机物代谢平衡遭到破坏，细胞不能及时进行自我修复，这是导致细胞凋亡的又一诱因。.本项目在细胞和分子水平上探讨PMP杀菌及窗效应发生的机制，对于今后更为科学的设计高强度PMP杀菌方法，进一步扩大高强度PMP在其它领域的应用具有潜在的应用价值。