结核分枝杆菌药物靶标蛋白NrdH氧还酶结构与相互作用的核磁共振研究

本项目主要通过核磁共振波谱学和其他生物物理、生物化学手段研究结核分枝杆菌中药物靶标蛋白NrdH氧还酶结构与相互作用。NrdH氧还酶是一类分子量较小的氧还酶类，具有谷氧还蛋白的序列特征和硫氧还蛋白的氧还酶特征。NrdH氧还酶通过与多种氧还酶类相互作用形成复杂的氧化还原网络，在结核分枝杆菌的应激反应以及在人体细胞内存活中起重要作用，是一个新的药物开发靶标蛋白。本项目通过核磁共振波谱学方法解析NrdH氧还酶及其相关氧还酶类的溶液结构，使用生化方法测量其氧还酶活性，对结构功能关系进行分析，提出其酶活性的结构基础和机制，并通过定点突变验证这些活性机制。在此基础上使用各种生物物理与生物化学方法分析NrdH氧还酶和其他氧还酶类蛋白质之间的相互作用及其对各种酶活性的影响和调控，分析其功能的结构基础和作用机制，获得相关氧还酶相互作用网络的调控机制，为药物设计和开发提供线索。

结核分枝杆菌的NrdH氧还酶（基因rv3053c编码）是结核分枝杆菌生长必须的蛋白，可能成为新的药物靶标蛋白。本项目对结核分枝杆菌的NrdH氧还酶进行了结构和稳定性的研究。虽然已有多个物种的NrdH氧还酶的结构得到解析，但它们都是氧化态的结构，而NrdH氧还酶发挥功能的状态是其还原态。在本项目的研究中，我们发现结核分枝杆菌NrdH氧还酶的还原态具有较低的稳定性，这可能是一直以来没有NrdH氧还酶还原态结构的原因。通过对比分析大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等不同物种的NrdH氧还酶的稳定性和结构，我们发现结核分枝杆菌NrdH氧还酶的还原态低稳定性的可能是由于缺少了一个螺旋和beta片层之间的相互作用。我们通过突变分析对其进行了验证，同时获得了一个具有稳定的还原态的结核分枝杆菌NrdH氧还酶突变体，解决了长期以来无法解析还原态结构的问题。在此基础上我们成功解析了结核分枝杆菌NrdH氧还酶的氧化态和还原态的核磁共振溶液结构，并对其主链动态特性进行了测定和分析。NrdH氧还酶作为结核分枝杆菌的必须蛋白，是一个可能的药物靶标，而其低稳定性的独特性质可能被药物所利用来破坏其功能，从而形成新的药物作用方式；我们解析的还原态结构则为药物设计提供了结构基础。我们解析了结核分枝杆菌中另一个NrdH同源蛋白NrdH2（后被命名为Mrx-1，由基因rv3198A编码）的还原态的结构。我们还研究了热纤梭菌中的一个NrdH同源蛋白（由cthe_0235编码）的氧化态和还原态的初步结构，并使用thermotargetron技术构建了该基因的敲除突变株用于功能分析。我们还通过与国内外研究人员的合作，对植物的一个谷氧还蛋白（和NrdH同为硫氧还蛋白超家族）GrxS16的结构功能进行了分析，发现其N端带有一个核酸酶结构域，我们解析了该结构域的核磁共振溶液结构并证实了其核酸酶的功能。我们发现GrxS16的N端核酸酶结构域和C端的Grx结构域之间能够形成一个分子内二硫键，该二硫键能够同时负调控两个结构域的功能，这是首次发现这种类型的负调控。