梭菌纤维小体调控因子信号传导的结构与分子机制的核磁共振研究

Cellulosome is one of the most efficient nanomachines for lignocellulose degradation in nature. The enzymatic components of cellulosome secreted by bacteria are regulated by the substrate types surrounding the cells. Recently, a number of ECF-type Sigma and Antisigma factors were discovered in several cellulosome-producing bacteria of Clostridia. These factors can sense the extracellular substrates and regulate the transcription and expression of cellulosomal genes, which are the major mechanism of complex cellulosome regulation. However, these factors have very low sequence homology with structure-known proteins, so the structural and molecular mechanisms of the signal transduction and regulation by them are not clear. This project will employ NMR spectroscopy and X-ray crystallography, combining with in vitro and in vivo functional experiments including interaction analysis, transcriptional activity assay, gene knock-out and complementary, to study the structures, key interaction sites, mechanism of specific recognition, and signal transduction mechanism of the cellulosome-regulating Sigma and Antisigma factors. This project will reveal the structural and molecular mechanism of signal trans-membrane transduction and signal transfer between regulation factors, which will provide insight understand of the cellulosomal regulation mechanism and establish a scientific basis for the Clostridium genetic engineering of cellulosome systems and their application for specific lignocellulose utilization.

纤维小体是自然界中可降解木质纤维素的最高效的分子机器之一，其酶的组成受到底物种类的调节。近年来发现梭菌等产纤维小体细菌通过ECF类型的Sigma和Antisigma因子来感应胞外底物组成，调节纤维小体组分的转录表达，是复杂纤维小体系统的最主要的调控方式。然而这些Sigma和Antisigma因子和已知结构蛋白的同源性很低，因此其信号传导和调控的结构分子机制还不清楚。本项目通过核磁共振波谱学和X射线晶体学，结合相互作用分析、转录活性、基因敲除与回补等体外、体内功能实验，对感应胞外底物调控纤维小体表达的Sigma和Antisigma因子及其复合体的结构、关键作用位点、特异性识别机制、信号传递机制等进行研究，揭示这些调控因子信号跨膜传导和因子间传递的结构与分子机制。本项目将使我们更加深入地理解纤维小体的表达调控机制，为针对特定木质纤维素资源的梭菌纤维小体系统的遗传改造和工业化利用奠定科学基础。

纤维小体是自然界中高效的木质纤维素降解分子机器，其酶的组成与胞外底物的种类相关，这种底物偶联的调控是通过一类新的sigma和antisigma因子SigI和RsgI来完成的。产复杂纤维小体的细菌基因组中都具有多对SigI-RsgI因子，负责针对不同底物类型启动特定纤维小体基因的转录。然而SigI和RsgI与已知结构蛋白的同源性很低，其信号传导和调控的结构分子机制还不清楚。本项目通过结构生物学、生物化学与分子生物学、微生物遗传与生理等多学科技术手段，对热纤梭菌的SigI-RsgI因子及其复合体的结构、相互作用、信号传递机制等进行了研究。我们使用核磁共振和X射线晶体学技术，解析了多个RsgI的单独结构域的结构，分析了多对SigI和RsgI的相互作用，解析了SigI1和RsgI1的复合体的结构，鉴定了相互作用的关键氨基酸残基，获得了SigI-RsgI之间特异性相互作用的结构基础，发现SigI-RsgI复合体代表了一类全新的sigma-antisigma因子结构类型。在复合体结构分析中，发现了SigI的C端结构域识别启动子-35区的关键区域。通过对热纤梭菌SigI和RsgI基因敲除突变株的表型分析，鉴定了热纤梭菌RsgI跨膜信号传导的分子机制，发现了RsgI的自酶切、寡糖ABC转运蛋白以及跨膜蛋白酶在纤维小体诱导表达信号传导中的重要作用。这些研究结果揭示了SigI和RsgI作为一类全新的sigma-antisigma因子类型的结构功能机制，发现了RsgI-SigI完成从胞外到特定纤维小体基因转录的信号传导过程的分子机制，使我们更加深入地理解了纤维小体的表达调控机制，为针对特定木质纤维素资源的热纤梭菌的遗传改造和工业化菌株构建提供了新的科学基础。此外，由于SigI-RsgI因子的独特性质，产纤维小体细菌中大量的SigI-RsgI因子亦为合成生物学提供了一个新的调控元件库。