结核分枝杆菌旋转酶的翻译后修饰及相互作用蛋白对DNA拓扑结构及药物抗性的影响

Tuberculosis (TB), caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis, is the world’s deadliest bacterial infectious disease. Drug-resistant tuberculosis is a global-health threat, particularly because of the existence of drug-resistant forms. Fluoroquinolones are among the drugs used to treat TB. DNA gyrase, the enzyme that controls DNA topology in Mycobacterium tuberculosis, is the target for fluoroquinolones. Our previous studies have shown that regulation of DNA gyrase affects mycobacterial drug resistance, but the mechanisms are poorly understood. Building on preliminary data on post-translational modification, we aim to elucidate how gyrase activity is controlled in M. tuberculosis and how this impacts on drug resistance and cellular processes. We expect to provide evidence that the modification of mycobacterial DNA gyrase modulates its activity and thus controls intracellular supercoiling and the susceptibility on the bacteria to antibiotics by using combination methods including genetic and biochemical approaches. The knowledge should lead to novel strategies to develop new accurate diagnosis methods.

结核病是由结核分枝杆菌通过空气传播引起人感染的慢性传染病，是导致人类死亡最多的传染病之一，全球约有1／3人口携带结核分枝杆菌，是新发病例的巨大储藏库。耐药结核的流行是世界性难题。氟喹诺酮类药物是耐药结核治疗的中流砥柱，其抗性的产生会增加耐药病人的死亡率。对于氟喹诺酮药物靶点比较清楚，靶点是结核分枝杆菌的DNA旋转酶。我们之前的研究显示调控DNA旋转酶影响其耐药性，但是相关机制还亟待研究。本项目计划利用蛋白垂钓和质谱等手段发现在不同生理状态下DNA旋转酶的修饰形式和相互作用蛋白；利用生化和遗传学等技术手段，在体内和体外系统解析蛋白水平的调控对DNA拓扑结构和药物抗性影响的机制。我们的工作将为深入理解分枝杆菌氟喹诺酮耐药机制、研发精准诊断技术和发掘新的作用药物靶点提供科学理论基础。

结核病是由结核分枝杆菌通过空气传播引起人感染的慢性传染病，是导致人类死亡最多的传染病之一；全球约有1／3人口携带结核分枝杆菌，是新发病例的巨大储藏库。耐药结核的流行是世界性难题。氟喹诺酮类药物是耐药结核治疗的中流砥柱，其抗性的产生会增加耐药病人的死亡率。对于氟喹诺酮药物靶点比较清楚，靶点是结核分枝杆菌的DNA旋转酶。我们之前的研究显示调控DNA旋转酶影响其耐药性，但是相关机制还亟待研究。本项目研究内容和结果如下：1）利用蛋白垂钓和质谱等手段获得DNA旋转酶相互作用的候选蛋白，包括DNA修复相关的RecA和RadA，DNA复制相关的DnaA，细胞分裂相关的FtsE，环丙沙星相关的MSMEG_1255和MSMEG_0387，提示DNA旋转酶参与多个生理过程。2）阐释DNA旋转酶相互作用蛋白-喹诺酮抗性蛋白（Qnr）的生物功能。利用全基因组测序、转录组分析、遗传学及生化等技术手段，首次揭示了喹诺酮抗性蛋白Qnr介导喹诺酮类药物耐药的新机制--QnrB与DNA复制起始因子DnaA相互作用，增加DnaA对单链oriC的亲和力，并促进DnaA-oriC开放复合物的形成，产生DNA复制应激，导致基因突变产生，包括喹诺酮抗性的基因突变。3）揭示了分枝杆菌五肽重复蛋白MfpA参与分枝杆菌耐受氟喹诺酮类药物的新机制。研究发现MfpA可以抑制DNA旋转酶的负超螺旋活性；并且仅在ATP存在的条件下，保护DNA旋转酶免受药物的损伤。晶体结构显示MfpA与DNA旋转酶的ATPase结构域直接相互作用，这种相互作用激活ATPase活性，改变DNA旋转酶构象，促使氟喹诺酮药物从DNA旋转酶-药物-DNA复合体中释放。我们的工作加深了对分枝杆菌氟喹诺酮的耐药机制的理解，为抗生素研发提供了新的思路。