梭菌的纤维小体组装模块的结构、相互作用与理性设计的核磁共振研究

Cellulosome from Clostridium is one of the highest efficient systems degrading lignocellulose in nature, and is also one of the most elaborate nanomachines. Studies on the assemble and mechanism of cellulosome can not only provide basis and clues to break the bottleneck for the biofuel production from lignocellulose, but also help people to design new artificial nanomachines in the field of biotechnology. In this project, we will firstly investigate the cohesin and dockerin modules, the assembling modules in cellulosome, from Clostridium acetobutylicum, a clostridium with special evolutionary position. We will determine the structures of each module and their complex by NMR spectroscopy, and analyze the interactions between the two modules to reveal the structural basis of the interaction. Secondly, we will study the inter-species interactions between assembling modules from various Clostridium species, and design new assembling modules with new inter-species specificity based on the general principle of the inter-species specificity. Finally, we will construct the artificial cellulosomes using the natural and new designed modules. The activities of various artificial cellulosomes will be compared and the roles of various modules in the cellulosome assemble will be analyzed. New clues of the highly efficient cellulose-degrading mechanism of cellulosome and schemes to design artificial nanomachines will be obtained in this project.

梭菌类微生物的纤维小体是自然界中最高效的降解木质纤维素的体系之一，也是自然界中最精巧的纳米分子机器之一。对纤维小体的组装和作用机制的研究不仅有助于为突破木质纤维素生产生物燃料的瓶颈提供基础和线索，而且有助于在生物技术领域设计其他功能的高效人工纳米分子机器。本项目从一个分类地位特殊的梭菌的纤维小体组装模块- - 丙酮丁醇梭菌的cohesin和dockerin模块出发，通过核磁共振方法解析他们的单个模块结构和复合体结构，分析模块间相互作用方式，揭示模块间相互作用特异性的结构基础。在此基础上，分析不同物种之间纤维小体组装模块的相互作用的种间特异性，总结模块相互作用的种间特异性的一般规律，并据此设计具有新的特异性的纤维小体组装模块。基于得到的新模块和已有的特异性模块，设计新的人工纤维小体，测定各种模块对纤维小体组装和活性的作用，为揭示纤维小体的高效降解机制和人工纳米机器的构建提供新的线索和方案。

梭菌纤维小体的组装模块是纤维小体协同作用的关键部件，本项目对多种纤维小体的组装模块的结构、相互作用和功能进行了研究，增加了人们对纤维小体组装复杂性的认识，为利用纤维小体进行木质纤维素生物燃料生产提供了新的元件和方案。本项目解析了丙酮丁醇梭菌的cohesin模块（CohA2）和dockerin模块（DocA）的核磁共振溶液结构，发现它们具有独特的相互作用界面，同时相互作用强度受到pH的调控。通过对相互作用界面和强度的仔细分析，本项目研究发现DocA在低pH下以一个界面结合CohA2，而在高pH下以另一个界面结合，这是首次发现纤维小体组装模块能够通过pH调控相互作用界面。本项目证实丙酮丁醇梭菌的纤维小体组装模块具有种间特异性，但相互作用较弱，通过这些模块组装的人工纤维小体状态不均一，组装人工纤维小体的协同作用因子低于其他物种的纤维小体组装模块。本项目发现以前文献报道的一个热纤梭菌的纤维小体组装模块Doc48S的核磁共振结构存在问题，重新解析修正了该蛋白的高质量核磁共振结构，发现该模块在溶液中具有和晶体复合体中相同的构象，同时还发现其C端存在一个顺式脯氨酸前肽键，这一工作解决了纤维小体研究中存在多年的关于dockerin溶液结构状态的争议。本项目对热纤梭菌具有不同数目组装模块的多种脚架蛋白对纤维小体活性的贡献进行了分析，揭示了各种协同作用对热纤梭菌的纤维素降解活性的贡献。本项目还发现在一种黄色梭菌的纤维小体组分中存在膨胀因子，通过组装人工纤维小体的方式证实膨胀因子可以显著增强纤维小体的活性，使人们对纤维小体复杂性有了更进一步的认识，也为纤维小体的应用提供了新的功能模块。本项目还对热纤梭菌的纤维小体调控因子SigI-RsgI进行了初步的结构和相互作用研究，为进一步研究纤维小体的调控打下了良好的基础。