黄（褐）籽甘蓝型油菜基因表达差异分析及定位

黄籽油菜由于具有相对较高的含油量和饼粕中蛋白质含量高、纤维素含量低、色素少等优点，正成为油菜品质育种的重要目标之一。.甘蓝型油菜自然种质中不存在黄籽资源。本项目选用我们实验室通过体细胞融合方法，从甘蓝型油菜和白芥属间杂种后代中选育出的稳定的黄籽株系（D244-18）为实验材料，利用新一代高通量RNA测序的数字基因表达谱技术(Illumina测序)，对黄/褐不同颜色油菜种子发育过程中RNA表达水平的差异进行研究并进行RT-PCR的验证；利用AFLP方法对黄籽和褐籽配制的杂交、回交群体进行遗传作图；通过生物信息学手段对RNA-Seq结果进行分析，根据所发现的SNP位点开发新的分子标记，并将其定位到该遗传连锁图谱上；研究结果对探讨黄籽性状形成的分子机制以及与黄籽性状形成的相关基因或变异位点具有重要的理论意义，同时为培育高产、优质油菜新品种以及开展黄籽油菜分子标记辅助育种奠定基础。

本项目选用纯黄株系W82和褐籽轮回亲本‘扬油6号’为研究对象，取得了下列研究成果：（1）通过高效液相色谱质谱联用技术，结合多酚物质紫外吸收特性、多级质谱裂解信息等，发现了91种类黄酮和羟基苯丙烯酸衍生物，鉴定了78种，其中55种为甘蓝型油菜首次报道。在此基础上，我们对黄/褐籽甘蓝型油菜种子发育过程中多酚物质含量进行比较，发现其多酚物质主要分为三类，即黄酮醇类、羟基苯丙烯酸类和原花色素类。不同颜色种皮其多酚物质含量差异很大，某些单一多酚物质含量差异可达十倍以上，这为了解油菜种皮色素成分含量和基因表达之间的关系打下基础。（2）通过RNA-seq技术对黄/褐籽甘蓝型油菜种子发育的5个时期的基因表达水平进行比较，发现563个褐籽发育相关的差异表达基因、397个黄籽发育相关的差异表达基因、以及42个黄、褐籽不同发育时期共有的差异表达基因。类黄酮合成路径的多个基因及转录因子在黄/褐籽甘蓝型油菜种子不同发育时期也存在显著差异。qRT-PCR验证表明上述基因的表达水平在黄、褐籽种子发育不同时期有明显差异，且与黄/褐籽种子发育过程中类黄酮类物质的积累和含量变化是一致的，这为进一步解析甘蓝型油菜黄籽性状形成的网络调控奠定了基础。（3）利用sRNA-seq对黄/褐籽甘蓝型油菜不同发育时期种子的miRNA表达水平进行比较，发现大量材料特异和时期特异的miRNA。以黄/褐籽6 WAF的sRNA-seq结果为例，发现53个miRNA在黄籽中上调表达，61个miRNA在黄籽中下调表达。这些差异miRNA包括miR156、miR168、miR171、miR172等，且对差异miRNA的靶基因分析发现候选靶基因主要为一些转录因子，如mi156可调控转录因子SPL、miR172可调控转录因子AP2的表达。（4）本项目已正式发表SCI论文7篇。2名博士生、3名硕士生参与了研究，其中有1名硕士生获江苏省优秀硕士论文。