新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料SaNa-1A不育的分子机理

Cytoplasmic male sterility (CMS) has an important function in heterosis. Currently, pol CMS and Shan2A CMS are widely used in China, thereby inducing the risks of single CMS cytoplasm in Brassica napus breeding. In this study, a stable sterile line (SaNa-1A) and a maintainer line (SaNa-1B) from backcrossing descendants of somatically hybridized B.napus and Sinapis alba will be used. Based on the mitochondrial genome sequencing and southern hybridization, orf122 has been confirmed as the sterile gene that causes CMS. For functional verification, several vectors of this gene will be constructed to transform normal rapeseed varieties. The energy metabolism, gene expression, mitochondria structure, and membrane permeability caused by orf122 will be deeply investigated to explore the molecular mechanism of this novel B. napus CMS using the transmission electron microscope and physiological and biochemical analyses, coupled with transcriptome and prokaryotic expression. This study would provide additional CMS resources of B. napus and a theoretical foundation of a sterile mechanism to develop and apply this sterile material.

细胞质雄性不育是油菜杂种优势利用的重要途径。目前我国油菜杂交种生产主要使用pol CMS和Shan2A CMS，长期使用同一不育胞质存在潜在的风险。本项目选用甘蓝型油菜与白芥体细胞杂种回交后代中选育出的不育性稳定的雄性不育系SaNa-1A和保持系SaNa-1B为实验材料，在线粒体全基因组测序和Southern杂交获得候选不育基因（orf122）的基础上，构建该不育基因花药特异性表达载体，通过转化常规油菜品种，验证该不育基因的功能。通过电镜观察、生理和生化分析，结合转录组分析和不育基因的原核表达，深入研究该不育基因对花药发育过程中能量代谢、基因表达模式、线粒体的结构和膜透性等的影响，从而解析不育基因orf122导致花粉败育的分子机理。通过本项目的实施，既丰富了我国油菜不育胞质的遗传资源，又为进一步开发和利用该细胞质雄性不育材料提供理论依据，因此，该研究具有重要的理论意义和应用价值。

杂种优势的利用是提高油菜产量的重要手段，细胞质雄性不育作为理想的授粉控制系统之一，为油菜增产作出了巨大的贡献。我们前期通过电融合的方法获得了白芥（Sinapis alba）和甘蓝型油菜（Brassica napu）体细胞杂种，在和甘蓝型油菜品种‘扬油6号’连续回交后代中选育出稳定的细胞质雄性不育系SaNa-1A及其保持系SaNa-1B。. 通过对不育系和保持系花器官形态学的观察发现，不育系雄性生殖器官花药短小、干瘪，表面无明显的花粉附着现象，花瓣皱褶。半薄切片观察发现，SaNa-1A CMS绒毡层未及时发生降解，小孢子彼此粘连在一起形成团状结构，被未发生降解的绒毡层细胞紧紧包裹着，并将其挤向药室中央，最终导致无成熟花粉粒的形成。超薄切片的研究表明，SaNa-1A CMS花药的发育在花粉母细胞时期就显现出缺陷，如细胞、核仁的体积明显较小，液泡化程度高，内质网、线粒体等细胞器结构发生异常。再加之不育系绒毡层之后又出现发育缓慢和降解延迟的现象，最终导致小孢子内含物全部消失，无成熟花粉的形成。生理生化和TUNEL分析表明，不育系在花粉母细胞时期，就出现了ROS积累的增加，而抗氧化酶系统功能又出现障碍，使MDA不断积累。同时，不育系花药线粒体的能量代谢显示出明显的缺陷，并进一步破坏ROS平衡，加之脯氨酸等物质的匮乏，共同抑制了小孢子的发育。而不育系小孢子PCD的发生和ROS的积累在时间上是平行的，绒毡层PCD的异常也进一步验证了细胞学研究的结果。因此，我们认为长期高于正常生理水平的氧化胁迫和线粒体功能障碍是造成不育系败育的重要因素。同时，我们应用RNA-Seq技术又对两系花药发育的关键时期（四分体时期）进行了转录组学的比较。对DEGs的进一步研究发现不育系很多涉及线粒体电子传递、氧化磷酸化、TCA循环等过程的基因下调表达，继而又引起调控花药发育的核基因表达量的变化，使花药出现败育的表型，尤其是ATP6、ATP9基因在不育系中的不表达，并结合生理指标的分析，我们推断线粒体能量代谢的障碍是不育系败育的直接原因。.