基于宿主蛋白靶点的黄连香薷饮抗流感病毒药效物质基础及作用机制研究

Traditional Chinese medicine (TCM) has unique advantages in treating the influenza. However, most of them are lack of explicit action mechanism and effective substances. Huangliang Xiangru Decoction (HXD) as the diaphoretic and dehumidizer agent, which is described in a famous TCM monograph "Leizheng Huoren Shu", is composed of 3 individual herbs: Coptidis Rhizoma,Mosla chinensis Maxim and Magnolia officinalis. Our last researches have found that HXD possess a wide range of pharmacological properties such as antiviral, anti-inflammatory and analgesic activities.Moreover, the extracts of Mosla Chinensis Maxim and Mangnolia officinalis from HXD both have the anti-influenza effects via inhibition of the TLR3 and NF-κB protein expression in the lung tissues of infected mice, suggesting that HXD may play a role in up-regulation Toll like reporters and RIG protein targets instead of directly inhibiting the virus itself or regulating the cytokines. To clarify the point, this study is to investigate the anti-influenza viral compounds and action mechanism of HXD by using molecular biology and modern chemical analysis methods with PK-PD and metabonomics research techniques. It will also reveal the signal transductions of TLR and RIG pathways regulating by HXD. It will provide experimental base for the quality control and clinical use of HXD,but also give a new method or ideal for the research on anti-influenza viral substances and its action mechanism of TCM.

中药及复方治疗流感具有独特优势，但药效物质和作用机制多不明确。黄连香薷饮出自《类证活人书》，由黄连、香薷、厚朴组成，为治疗"感寒伤湿"的代表方。前期研究表明，该方具有抗病毒、抗炎、镇痛作用；香薷、厚朴可抑制感染流感病毒小鼠肺组织TLR3和NF-κB蛋白表达水平，提示该方可能是通过对宿主Toll样和RIG样蛋白靶点的调控而发挥作用，而非当前研究普遍认为的对病毒的直接抑制或机体细胞因子的调节作用。为证实这一假说，本项目以宿主抗病毒免疫反应的TLRs蛋白为切入点，联用分子生物学、药动学、代谢组学和化学等技术，从整体-器官-细胞三个层次，①明确该方的最佳配伍和有效成分；②揭示其调控宿主抗流感病毒免疫反应的主要作用层次和靶点；③阐明其对Toll通路之间信号传导的作用机制。本研究可为该方的合理配伍、质量控制和临床应用提供依据，同时也为中药复方抗流感病毒的药效物质及作用机制研究提供新的研究思路和方法。

中药复方治疗流感具有独特优势。本项目在前期研究基础上，提出研究假设：古方黄连香薷饮可能是通过对宿主蛋白靶点的调控而发挥抗流感作用。研究内容包括：1.抗流感病毒作用的拆方研究。2.整体药效和药效物质研究。3.作用机制研究。.研究结果表明，1.对全方拆方研究显示：香薷、黄连-厚朴药对和黄连香薷饮全方均具有显著的抗流感作用，且黄连-厚朴药对的药效最佳。2.整体药效和药效物质研究显示：黄连香薷饮能显著降低流感感染小鼠的肺指数，提高肺指数抑制率，缓解流感病毒所致小鼠肺炎的病变情况；建立了黄连香薷饮的HPLC指纹图谱，得到25个共有峰，鉴定了其中4个峰，分别为盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、厚朴酚与和厚朴酚；血浆中检测到芹菜素、厚朴酚、和厚朴酚及盐酸小檗碱等药效成分，经鉴定芹菜素为君药香薷黄酮类成分的体内代谢产物，厚朴酚与和厚朴酚为臣药厚朴酚类成分的体内代谢产物，盐酸小檗碱为佐使药黄连的生物碱类成分的体内代谢产物。3.作用机制研究。(1)通过ELISA法检测流感感染小鼠血清中细胞因子和抗氧化因子的含量分析，黄连香薷饮①可显著降低感染小鼠血清中IL-6、TNF-α和 IFN-γ细胞因子的水平，提高IL-2的水平。通过调节小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和 IFN-γ的分泌，提高抗病毒作用和免疫调节作用，从而减轻病毒对机体的损伤；②可显著降低感染小鼠血清中NO的水平，提高SOD和GSH的水平，提示黄连香薷饮可通过提高机体的抗氧化能力，减轻流感病毒所致的病毒性肺炎。⑵通过采用荧光定量PCR技术与蛋白印迹技术分别检测流感感染小鼠肺组织细胞中TLRs信号通路关键靶点TLR3、TLR7、MyD88、TRAF3和NF-κB p65的基因与蛋白表达水平，研究显示黄连香薷饮可显著降低感染小鼠肺组织细胞中TLR3、TLR7、MyD88、TRAF3和NF-κB p65基因和蛋白的表达水平。综上所述，黄连香薷饮抗流感病毒的作用机制是通过调节机体的免疫功能、提高机体的抗氧化能力和调控宿主TLRs信号通路多个环节的基因与蛋白表达共同作用的结果。本研究结果可为该方的合理配伍、质量控制和临床应用提供依据，同时也为中药复方抗流感病毒的药效物质及作用机制研究提供新的研究思路和方法。