抗流感病毒寒热药对黄连-厚朴调控TLRs信号通路的作用机制研究

Traditional Chinese medicine (TCM)theory has unique advantages to prevent and treat influenza. Doctors of TCM propose the therapy both with cold and heat to treat the influenza. Previous studies had shown that Huanglian Xiangru Decoction(HXD) had an effective function in clinical practice and animal model infected with influenza virus. What's more, the research of separated recipes shows that Coptis chinensis-Mangnolia officinalis medicine pair(CMMP) had the better anti-influenza virus efficacy than HXD. But the mechanism of action has not been described.The project intends to interpret the mechanism of action of anti-influenza virus about CMMP from two ways:metabolomics and TLRs signal pathways. To clarify the point, this study is to investigate the potential biomarkers of CMMP which regulate and control host protein targets by using molecular biology , methods with pharmacokinetics and metabonomics research techniques in description on molecular level and whole level. It will also reveal the level and target of regulation of CMMP on the host which has anti-influenza virus immune response and reveal the signal transductions of TLRs pathways regulated by CMMP. It will not only provide reliable evidence of evidence-based medicine for clinical application and the scientific connotation of cold and heat therapy for influenza,but also give a new path for the research on anti-influenza viral substances and the action mechanism of TCM.

中医药防治流感优势独特，中医倡导"寒热并用"的治则。项目组前期研究表明，寒热并用古方黄连香薷饮在临床和流感动物模型中疗效肯定，拆方研究显示，该方中典型的"寒热药对"黄连-厚朴抗流感药效更佳，但其抗流感的作用机制研究尚属空白。本项目拟从代谢组学和TLRs相关信号转导通路两条途径，来诠释寒热药对黄连-厚朴抗流感病毒的作用机制。以宿主抗病毒免疫反应的TLRs蛋白为切入点，联用分子生物学和代谢组学等技术，从整体和分子水平，①明确该药对调控宿主蛋白靶点的潜在生物标志物；②揭示其调控宿主抗流感病毒蛋白靶点的主要作用层次和靶点；③阐明其对TLRs信号通路的传导作用机制。本项目的研究可为诠释流感"寒热并治"的科学内涵及临床应用提供可靠的循证医学证据，同时也可为中药复方抗流感药效物质基础及作用机制研究提供新的途径。

中医药防治流感优势独特，中医倡导“寒热并用”的治则。项目组前期对寒热并用古方黄连香薷饮拆方研究发现，其中的黄连-厚朴寒热药对抗流感药效优于整方，基于此提出假设：黄连-厚朴药对可能通过调控TLRs信号通路而发挥抗流感作用。研究内容包括：⑴抗流感作用的最佳配伍比例研究；⑵抗流感作用的提取工艺研究；⑶抗流感的药动-药效(PK-PD)研究；⑷抗流感的药效及作用机制。.结果表明，⑴文献研究和实验研究均显示药对抗流感的最佳配比为1:1。⑵正交试验-多目标遗传算法优选得药对抗流感作用最佳提取工艺为：加药材12倍量的水于88 ℃提取3次，每次49 min。⑶药对大鼠灌胃给药后，不同时间点含药血浆中盐酸小檗碱及厚朴酚含量药-时曲线均符合二室开放模型；不同时间点含药血清对流感病毒感染细胞内病毒的抑制作用和IFN-β的分泌量的药效学模型均符合二室开放模型。PK-PD相关性分析显示药对含药血清的体外抗流感作用与盐酸小檗碱及厚朴酚的整合血药浓度呈正相关。⑷药对能显著降低流感感染小鼠的肺指数，提高肺指数抑制率、脾指数及胸腺指数，缓解流感病毒所致小鼠肺炎的病变情况。ELISA法检测结果显示：药对可显著降低流感病毒感染小鼠血清中IL-6、TNF-α和 IFN-γ细胞因子的水平，提高IL-2的水平；降低感染小鼠血清中NO的水平，提高SOD和GSH的水平，提示药对可通过提高抗病毒作用和机体的抗氧化能力及免疫调节作用，从而减轻流感病毒所致的病毒性肺炎损伤。RT-PCR和Western Blot技术检测结果显示，药对可显著降低感染小鼠肺组织细胞中TLR3、TLR7、MyD88、TRAF3和NF-κB p65基因和蛋白的表达水平。综上所述，黄连-厚朴药对抗流感的作用机制是通过调节机体的免疫功能、提高机体的抗氧化能力和调控宿主TLRs信号通路的基因与蛋白表达多个环节共同作用的结果。本研究结果可为寒热药对的合理配伍、质量控制和临床应用提供依据，也为中药复方抗流感病毒的药效物质及作用机制研究提供新的研究思路和方法。