艾灸驱动SIRT1与P300介导的 FOXP3/ RORγt 翻译后乙酰化修饰调节肠道稳态的机制研究

Previous studies have revealed the mechanism that acupuncture and moxibustion can maintain the intestinal homeostasis by regulation of Th17/Treg axis, but the upstream regulatory mechanism is not yet clear. New researches indicate that post-translational modifications induced by various internal and external enviroment alternation is the common targets of different treatments. SIRT1 and P300 mediated deacetylation and acetylation play a crucial role in the stablization of FOXP3/RORγt, which are key upstream traslational factors of Th17/Treg axis. Based on this, we propose that "acupuncture and moxibustion can drive the post-translational modification and thus influence the steady-state of translational factors which then induced the homeostasis of the gut". The post translational modification features of the Treg and Th17 cell subsets after moxibusition will be studied by using high-throughput analysis method, the acetylational interaction between SIRT1 ,P300 and FOXP3/ RORγt will be anlysis. Finally antagonists and gene knockout mice will be used to verify the above modification .This study will reveal the mechanism that moxibustion modulate FOXP3/RORγt transcription factors by driving SIRT1 deacetylation and P300 acetylation modification , and prove that Treg/Th17 stability and gut homeostasis can be influenced by this acetylation modification.

前期研究揭示了针灸通过Treg/Th17平衡维持肠道稳态的作用机制，但具体调控机制尚不清楚。新近研究显示，内外环境共同驱动转录因子的翻译后修饰是各种治疗手段的共同靶点，SIRT1去乙酰化修饰和P300乙酰化修饰是调控Treg/Th17轴上游核心转录蛋白FOXP3/RORγt活性的重要途径，因此提出“针灸驱动体内蛋白翻译后修饰发挥稳态调控作用”的假说。以溃疡性结肠炎小鼠为模型，运用高通量方法分析艾灸对模型小鼠Treg和Th17细胞亚群蛋白修饰特征的影响效应，整合多种技术手段研究艾灸对SIRT1和P300介导的FOXP3/RORγt乙酰化修饰的驱动作用及其对Treg/Th17功能稳态的调节效应，并探究在SIRT1或P300乙酰化修饰被阻断或缺失时艾灸的上述调控作用是否改变，以揭示艾灸通过驱动乙酰化修饰调控转录蛋白活性并促进肠道稳态的关键机制，为针灸治疗肠道疾病提供新的科学依据。

针灸对肠道稳态多层次和多水平的调节作用与其能显著改善代谢免疫交互的关键靶点—Treg/Th17平衡有着直接相关性，并且对其上游核心调控蛋白FOXP3及RORγt的表达也有显著的稳态维持和改善作用。但是针灸调控FOXP3/RORγt转录进而稳定Treg/Th17平衡轴的关键机制尚不清楚。本课题围绕“针灸对SIRT1介导的去乙酰化修饰和P300介导的乙酰化修饰的调控可能是其调节体内FOXP3/RORγt翻译后修饰进而稳定Treg/Th17平衡和维持肠道稳态”这一关键科学问题，首先运用高通量TMT泛抗体蛋白质修饰组学技术分析艾灸治疗对溃疡性结肠炎小鼠乙酰化蛋白修饰组学特征的影响，发现艾灸可以增高UC小鼠降低的乙酰化修饰水平，相关的乙酰化酶和去乙酰化酶均出现明显变化。接下来采用靶向蛋白定量技术、分子生物学技术等检测了结肠组织去乙酰化转移酶SIRT1和乙酰化酶P300的表达水平，发现艾灸降低了结肠炎小鼠结肠中SIRT1的表达，同时增加了P300的表达。并且艾灸对结肠炎的治疗效果被SIRT1抑制剂EX527增强，而P300抑制剂Garcinol干预后结肠炎症明显加重。在体外研究中，通过观察Garcinol和EX527对LPS诱导的结肠上皮细胞上清液炎性因子的影响，进一步证实了SIRT1/P300平衡轴对结肠上皮细胞炎症相关过程有重要影响。为进一步明确SIRT1/P300与Treg和Th17细胞平衡轴的关系，在体外实验中分别采用激动剂和抑制剂干预，观察CD4+T细胞的分化方向，发现去乙酰化酶Sirt1能负性调控小鼠体内Treg/Th17平衡轴。后续体内验证实验显示，艾灸能调节UC小鼠体内FOXP3与RORγt的转录水平，且SIRT1不仅与CD4+T细胞存在共定位关系，并且与CD4+T细胞存在同步变化关系；进一步运用生物信息学、基因突变等方法对具体发挥作用的乙酰化修饰位点进行研究，发现HSP90B1-K142位点的异常乙酰化是艾灸发挥作用的关键靶点。本研究揭示了艾灸通过驱动 SIRT1 和 P300介导FOXP3/RORγt转录进而稳定Treg/Th17平衡轴维持肠道稳态的生物学机制。