小窝蛋白在海洋模式动物海鞘脊索发育中的角色

Caveolae are abundant cell-surface organelles playing important roles in signal transduction and mechanosensing. it has been revealed that caveolae are formed through assembly of the transmembrane coat proteins caveolin and cavin on the plasma membrane. Dysfunction of caveolae has been highlighted by the links to human diseases, including muscular dystrophies and cancer. However, the mechanism underlying the those diseases and the roles of caveolin on embryogenesis remain elusive.. In previous studies, we found the existence of caveolae on the notochord cell membrane in marine model animal, Ciona intestinalis. We also found that caveolin gene expressed in the notochord during Ciona embryogenesis, and its protein specifically localized at the apical membrane of the notochord cells. Based on these intriguing findings, we have great interests to further figure out the roles of caveolin in Ciona embryogenesis and notochord morphogenesis by CRISPR/Cas9-mediated gene knock out, Immunofluorescence, and confocal time-lapse imaging technical approaches. In this proposed research, we will mainly focus our work on the following three aspects: the molecular mechanisms of caveolae formation in Ciona notochord, the relationship between the apical membrane growth and caveolin vesicle dynamics including endocytosis and exocytosis, and the contributions of caveolin on the lumen formation and expansion during notochord tubulogenesis...Results of our investigation will not only provide novel insights in Ciona embryogenesis and notochord morphogenesis, but also have far-reaching impact on our understanding and treatment of several human diseases resulted from mutations in caveolin and its related regulators but their pathology has not been well understood.

由小窝蛋白聚合导致的向内凹陷的胞膜小窝是细胞膜表面的重要结构，具有传导信号、感受机械刺激等重要功能。胞膜小窝功能的缺失常导致肌肉萎缩症和癌症等人类疾病，但这些疾病的发生机制及小窝蛋白在胚胎发育中的角色还不甚清楚。我们在研究中观察到海洋模式动物海鞘脊索细胞膜上存在胞膜小窝，并证实小窝蛋白基因在海鞘胚胎中大量表达、其蛋白特异性地富集在脊索细胞顶端膜区域。本项目将以这些前期发现为线索，采用基因敲除、免疫组化和实时影像等分子细胞遗传发育生物学技术，研究海鞘中胞膜小窝形成的分子机制、小窝蛋白囊泡的内吞和胞吐与脊索细胞顶端膜生长的关系，以及小窝蛋白在脊索管腔液形成和膨胀过程中的作用等。预期结果将揭示小窝蛋白在海鞘胚胎发育中的角色和功能，阐明脊索细胞调控表面积大小和感受胞外微环境的分子机制。希望揭示出来的这些机制能够帮助我们了解胞膜小窝功能障碍性疾病的病理过程，为此类疾病诊断及治疗提供线索。

本项目研究了小窝蛋白在无脊椎动物和脊椎动物进化过渡节点脊索动物海鞘中的角色和功能。从海鞘基因组中鉴定了3个小窝蛋白编码基因，发现Cav-a和Cav-b在胚胎发育阶段表达，而Cav-Y仅在成体表达。序列比对及系统进化树分析表明海鞘Cav-a同脊椎动物Cav1/2同源。项目重点开展了Cav-a表达及功能研究。原位杂交和启动子分析表明，Cav-a特异表达在海鞘的脊索和肌肉组织。抗体免疫荧光数据显示其在细胞内形成囊泡，并定位在细胞膜上。.利用体外人工膜系统、人培养细胞株系以及缺失小窝蛋白的Cav-1-/-细胞系和电镜观察，我们充分证明海鞘的小窝蛋白分子具有诱导细胞膜弯曲内陷形成胞膜小窝的功能。这和脊椎动物小窝蛋白需要同伴侣分子Cavin共同作用才能在细胞膜上形成小窝结构不同，我们首次证明脊索动物的小窝蛋白具有诱导细胞膜内陷的分子功能。通过对海鞘肌肉和脊索中的小窝形状定量统计，发现海鞘胞膜小窝形态同脊椎动物的胞膜小窝结构存在差异。. 利用显微注射Morpholino，在海鞘胚胎中整体敲低小窝蛋白Cav-a的表达，发现胚胎尾部变短，脊索管腔不能形成。电镜观察发现脊索和肌肉细胞中胞膜小窝结构消失，证实Cav-a功能同小窝凹陷结构直接相关。另外，项目还阐明了小窝蛋白通过囊泡定向运输方式特异性定位在海鞘脊索管腔表面，抑制小窝蛋白囊泡运输导致脊索管腔不能形成。通过Dominant negative突变体干扰小窝蛋白功能，证实小窝蛋白在海鞘脊索和肌肉组织通过形成的胞膜小窝结构来感应游泳和组织生产所产生的机械生物力，并通过拉平这些凹陷结构调控组织和细胞的形态从而应对外界环境胁迫，维护组织完整性，维持胚胎运动能力的生物学功能。 .项目研究结果揭示了小窝蛋白在海鞘胚胎发育中的角色和功能，为从进化角度系统理解小窝蛋白分子功能提供了重要证据。所揭示出来的这些机制能够帮助了解导致胞膜小窝功能性障碍的病理过程，为此类疾病诊断及治疗提供线索。