软骨调节素在海鞘脊索腔液形成中的分子调控机制

Chondromodulin (ChM) is a glycoprotein, which was identified as a vertebrate-specific functional extracellular matrix component that not only stimulates proteoglycan synthesis in cultured chondrocytes but also inhibits the growth of vascular endothelial cells in vivo, presenting bifunctional activities depending on the target cell type. It also played essential role in embryogenesis. However, the underlying molecular mechanisms remain elusive. . In previous studies, we found chm highly expressed in notochord in marine model animal, Ciona savignyi. Preliminary knockout results showed that chm was required for notochord lumen formation and expansion. Based on these intriguing observations, we have great interests to further figure out the roles of ChM in notochord lumen formation and expansion during Ciona notochord tubulogenesis by CRISPR/Cas9-mediated gene knockout, Immunofluorescence, yeast two-hybrid system and confocal time-lapse imaging technical approaches. In this proposed research, we will mainly focus our work on the following three aspects: the vesicle trafficking pathways of ChM protein in notochord cells, the molecular mechanisms of ChM on notochord lumen formation and expansion, and the cellular activities of recombinant Cs-ChM in vitro. . Results of our investigation will not only provide novel insights in effects of extracellular matrix on Ciona embryogenesis and notochord morphogenesis, but also reveal the new functional of ChM in cell growth, migration and proliferation, which have the potential applications on cancer treatment.

软骨调节素是在脊椎动物中发现的一类细胞外基质糖蛋白, 在体外被证实具有刺激软骨生长和抑制血管生成的双重功能；在胚胎发育过程中也具有重要调控作用，但其作用的分子机制不清楚。申请人前期工作发现，软骨调节素在重要进化节点的海洋尾索动物海鞘脊索中大量表达。初步实验表明，其与脊索腔液形成有关。本项目将以此为基础，采用免疫组化、基因敲除和共聚焦显微镜观察等技术手段，研究软骨调节素在脊索细胞中的运输传递途径和其对脊索腔液形成和膨胀调控的分子通路。研究结果将阐明软骨调节素在海洋尾索动物胚胎发育中的作用，并有望发现其在调控细胞形态和迁移等方面具有的新生物学功能，为理解细胞外基质蛋白对管腔器官形态发生和稳态维持调控机理提供新认识。在此基础上，我们将优化海鞘软骨调节素蛋白重组表达系统，大量表达并回收重组的海鞘软骨调节素，利用血管内皮和肿瘤细胞系等鉴定体外重组海鞘软骨调节素的生物活性，为将来开展应用研究奠定基础。

软骨调节素是一种跨膜糖蛋白，具有促进软骨细胞生长，同时抑制血管生成等多种生物学功能。本项目利用分子生物学、免疫组化、基因敲除和共聚焦显微镜观察等技术手段，开展了软骨调节素在海鞘脊索细胞中表达模式及其运输传递途径和其对脊索腔液形成和膨胀的分子调控通路研究。. 本项目的工作首先证实软骨调节素大量且特异表达在海鞘脊索细胞中，抗体染色及融合蛋白定位结果显示其定位于脊索细胞的高尔基体、顶端膜上以及管腔的腔液中。通过细胞器标记荧光融合蛋白质粒转染海鞘胚胎实验，发现ChM蛋白与Rab5无明显的共定位，而与Rab7、Rab11共定位，表明ChM蛋白通过Rab7和Rab11囊泡循环途径在细胞内运输。我们还发现ChM糖基化位点突变后，ChM在细胞质中呈现弥散状，显示ChM的糖基化对与其运输和定位具有重要的作用，而且其N-linked糖基化位点突变使脊索腔液形成异常，且不能进行有效膨胀。. 为了阐明ChM的功能，我们利用CRISPR/Cas9敲除了海鞘脊索细胞ChM基因，发现在ChM-KO胚胎中脊索腔液不能正常形成，而顶端膜标记蛋白Caveolin仍然能够正常定位，表明ChM是脊索管腔膨胀所必需的但并不影响脊索细胞的极性。为了解析软骨调节素调控脊索腔液形成和膨胀的分子通路，我们利用酵母双杂交技术筛选ChM的互作蛋白，继而通过CO-IP验证实验，证实海鞘ChM与Fibronectin和Lurap1互作。而且，我们发现是ChM的成熟肽mChM与Lurap1 C末端的PDZ-binding motif互作。我们进一步的工作表明Lurap1影响细胞骨架微丝和微管的动态，进而影响ChM细胞内囊泡运输。这样，我们就解析出一条ChM通过与Lurap1互作，进而调控脊索细胞中细胞骨架的动态，从而调控腔液蛋白的运输和膨胀的分子作用通路。