牦牛体内降解β-胡萝卜素相关酶基因结构特征及表达差异性

There are many characteristics of yak adapting harsh environment in nutrition and metabolism, such as yak can accumulate carotenoids compounds including beta-carotene in fat that has special yellow color. There is obvious difference between the yellow fat of yak and common livestock, but the formation of fat yellow both in yak and others livestock has relationship with the enzyme of carotenoids metabolism. On the basis of existing research, the cDNA, promoter and intron sequences of the beta-carotene degradation enzymes（BCMO1，BCDO2，RDHE2） will be cloned by using of RT-PCR, Smart-race PCR and conventional PCR, and then the analyses of gene and protein structure will be conducted. The localization of three beta-carotene degradation enzymes in tissues and cells will be investigated with immunohistochemical method, and the genes will be mapped on chromosomes with multicolor in situ hybridization technology. Meantime, we will investigate the gene expression and regulation of three beta-carotene degradation enzymes responding to nutrition level of beta carotene with Real-time PCR and Western blotting. Further genome-wide association study (GWAS) identified SNPs (single nucleotide polymorphisms) which showed significant gentotype between yak and common cattle will be done. The aims of this project are to investigate the effects of beta carotene degradation enzyme on yellow fat and the special metabolic mechanism of beta-carotene in yak from molecular level.

牦牛脂肪对β-胡萝卜素等类胡萝卜素化合物的高效富集是牦牛在营养代谢方面适应高寒生境环境的重要特征之一，牦牛脂肪的黄色与普通家畜脂肪黄变有明显不同，但黄色脂肪的形成与类胡萝卜素降解酶有直接关系。在现有研究的基础上，利用RT-PCR、Smart-race PCR和常规PCR克隆3种β-胡萝卜素降解酶（BCMO1，BCDO2，RDHE2）的cDNA、启动子及内含子序列，分析β-胡萝卜素降解酶的基因及蛋白质结构特征；利用免疫组化和多彩荧光原位杂交技术进行β-胡萝卜素降解酶组织细胞及基因染色体定位；利用Real-timePCR和Western blotting方法从mRNA及蛋白质水平探讨3种酶的表达特征，研究β-胡萝卜素营养水平对降解酶表达的影响； 进行3种酶基因SNP位点筛查，力求从分子水平探讨β-胡萝卜素降解酶对牦牛黄色脂肪形成及β-胡萝卜素特殊代谢机理中的作用。

牦牛（Bos grunniens）为青藏高原特有畜种，其脂肪颜色为黄色，β-胡萝卜素（β-C）作为维生素A的前体物是导致形成黄脂的主要原因，为了深入探究牦牛黄色脂肪形成机理及在反刍动物体内类胡萝卜素代谢分子机制，项目系统研究了牦牛在不同营养季节β-C 降解酶在牦牛组织中的含量及酶活性差异；进行了类胡萝卜素相关代谢酶BCMO1和BCO2基因的克隆、定量表达、基因及蛋白结构分析、以及不同营养水平对BCMO1基因及蛋白表达的影响研究；β-C补饲对牦牛组织中β-C含量、类胡萝卜素降解酶活性、BCMO1基因和蛋白表达水平的影响及相关类胡萝卜素代谢调控因子表达影响的研究，也研究了β-C的营养水平对牦牛肉感官及香气品质的影响，为牦牛的营养补饲提供了基础数据。主要研究结果如下：.（1）牦牛BCMO1基因序列全长为1916bp，BCO2为2043bp，BCMO1基因5＇非编码区包含的启动子元件TATA盒保证了基因转录的正确定位，BCO2基因在其核苷酸序列发生了无义突变，使其编码的氨基酸残基发生了改变。.（2）不同营养时期BCMO1和BCO2基因在牦牛肌肉、肝脏及各肠道组织中均有表达，BCMO1和BCO2基因的组织表达水平与类胡萝卜素的摄入水平呈一定的相关性，可能在牦牛的维生素代谢调节和季节性营养适应机制方面发挥着重要作用。.（3）通过构建载体，成功制备了BCMO1单克隆抗体，Western blotting检测BCMO1蛋白在牦牛各组织器官中均有表达，且随β-C添加水平的升高，其表达量呈现先升高后降低的趋势（P<0.05）。.（4）牦牛血清、消化肠内容物、肌肉、体脂、腹腔脂肪及几乎所有组织器官中β-C和维生素A含量随β-C添加量的增加呈现上升趋势；牦牛脂肪色度亮度L*呈现降低的趋势，而黄度b*增加（P<0.05），对红度a*无明显影响（P>0.05），β-C的营养水平对牦牛肉感官及香气品质有影响。.（5）牦牛各组织中β-C降解酶活性有差异，随日粮中β-C添加水平的升高，在牦牛大部分组织中β-C降解酶酶活性和比活力呈现出先降低后升高的趋势。.（6）牦牛肠道中BCMO1和BCO2及4个相关代谢调控因子基因ISX、PPARγ、SR-B1及RAR的基因表达变化趋势有差异，BCMO1表达抑制可能使BCO2和ISX表达量增加，进而导致牦牛体内类胡萝卜素代谢途径出现特异性变化，这可能是牦牛出现黄色