细菌中类胡萝卜素降解关键酶基因克隆与酶降解机理研究

香气在很大程度上决定人们对食品的喜好，类胡萝卜素降解产物降异戊二烯类化合物能够极大地丰富食品的香气。本课题拟以自主分离得到的一株高效降解胡萝卜素的细菌菌株为试材，在分离纯化并测序的基础上，利用兼并PCR以及RACE技术获取该酶的全长基因序列，进而进行真核表达（酿酒酵母），并研究其酶学特性以及酶反应动力学，以不同类胡萝卜素作为底物，进行酶催化反应，通过分析降解产物组成，判断酶作用底物位置，揭示该酶催化类胡萝卜素降解的机理。本研究对于加深人们对降异戊二烯化合物的认识，揭示细菌来源的类胡萝卜素降解产香关键酶的催化机理具有重要的学术意义和应用价值。

本研究以巴氏葡萄球菌TS-82为材料，在研究微生物菌株的特性；提高微生物产酶量；类胡萝卜素裂解酶的分离纯化；酶学性质评价；类胡萝卜素裂解酶催化不同类型的类胡萝卜素底物生成的产物测定；推断类胡萝卜素裂解酶的作用机理等方面取得了大量研究成果。.对该微生物的致病性及耐药性进行研究，结果表明该菌株不产生与毒素相关的酶，不具备致病性，可安全用于食品加工；对该微生物降解β-胡萝卜素的规律进行研究，研究表明在pH3.4的条件下，经过6h的培养后，该微生物可以完全降解β-胡萝卜素；微生物催化β-胡萝卜素降解的降异戊二烯化合物主要为β-柠檬醛、紫罗兰酮、紫罗兰醇；筛选得到了最佳培养基组成及培养条件；对粗酶的酶学性质进行了系统研究，其最适反应温度为60℃，耐热温度为50℃，在pH值为1-3范围内能维持较高的酶活；采用强阴离子交换柱、半制备色谱柱及多肽分子筛等纯化技术，得到纯度为95.6%的酶液；利用柱层析纯化后的酶，分别作用于β-阿朴-8'-胡萝卜醛、β-胡萝卜素、玉米黄质、角黄质、虾青素和番茄红素六种底物，结果发现所得纯酶可催化降解前五种底物，未检测到其体外作用于番茄红素的活性；采用Lineweaver-Burk法作图，求取米氏常数和最大反应速率，结果表明该酶与五种底物亲和力排列为：玉米黄质>虾青素>β-胡萝卜素>角黄质>β-阿朴-8'-胡萝卜醛；关于酶学特性，研究发现该酶最适温度为50-60℃，稳定温度为50℃以下；该酶最适pH为3.0；Al3+和Fe3+是该酶的强效催化剂，Fe2+是该酶的强效抑制剂；经LC-APCI+/MS鉴定，这五种底物生成的非香气物质主要为其环氧化物；利用GC-MS检测香气物质，结果表明所得纯酶催化β-阿朴-8'-胡萝卜醛和β-胡萝卜素产生的香气物质主要是β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮-5,6-环氧化物、β-环柠檬醛，所得纯酶催化叶黄素类底物产生的香气物质是β-紫罗兰酮衍生物。综合可推断出该酶作用于β-阿朴-8'-胡萝卜醛和β-胡萝卜素底物的作用位点是C9-C10和C7-C8；其作用于叶黄质类底物的作用位点是C9'-C10'双键位置。另外经混菌发酵后的沙棘果酒中降异戊二烯化合物和多酚物质的含量明显提高。对该酶的N端测序、酶蛋白的结构等研究虽然采取了多种方法和分析手段，都没有取得理想结果，无法进行基因克隆及表达研究。