沙棘源微生物降解类胡萝卜素产香的酶学特性及酶编码基因的异源表达研究

本项目拟开展微生物降解类胡萝卜素的酶学特性及酶编码基因的异源表达研究，以已经从沙棘汁中分离得到的具有高效降解β-胡萝卜素的微生物菌株为研究材料，采用生化及分子生物学手段，对可降解β-胡萝卜素产生C13-降异戊二烯香气化合物的微生物酶及酶基因展开系统研究，研究包括酶学性质、酶蛋白质分离纯化、酶蛋白N-端氨基酸测序，酶基因克隆及异源表达，通过此内容研究揭示类胡萝卜素的生物降解机理；为采用微生物或酶生产降异戊二烯香料化合物及微生物调香改善食品香味品质提供技术依据；为构建具有应用价值的工程菌株，采用生物技术方法生产降异戊二烯香气化合物奠定基础。

本研究在鉴定类胡萝卜素降解菌；β-胡萝卜素降解酶的酶学性质评价;提高微生物产酶量；β-胡萝卜素降解酶降解产香及香气化合物分析；β-胡萝卜素降解酶降解不同类型的类葫芦卜素化合物，β-胡萝卜素降解酶的分离纯化等方面取得了大量研究成果。. 鉴定结果表明类胡萝卜素降解菌为葡萄球菌属；在pH3.4条件下，微生物可快速降解培养基中的β-胡萝卜素。粗酶液降解β-胡萝卜素的前期反应呈零级反应模式，后期反应呈一级反应模式；此酶的最适反应温度50℃，最适pH3.1，Al3+能增强酶活，而Fe2+会降低酶活，米氏方程1/V=26.106*1/S+2.714；最大反应速度Vmax=0.367μmol•min-1；米氏常数Km=9.621（μmol/L）。微生物和粗酶液降解β-胡萝卜素的产物中含有β-柠檬醛、紫罗兰酮、紫罗兰醇及3种萘同系物等降异戊二烯化合物；培养基组成及培养条件对该微生物产酶及酶活性有明显影响；采用强离子交换柱MONO Q 10/100 GL (10×100mm)、半制备色谱柱C18(250 mm × 10 mm, 10μm)及多肽分子筛Superdex peptide 10/300 column (10×300-330 mm)等纯化技术，得到纯度为95.7%的酶液，测得该酶分子量为656D；纯化酶酶学性质的研究表明：最适反应温度65℃；在60℃处理1h，酶活降低，降解反应活化能30.617 kJ / mol；在pH值2.6-3范围内能维持较高的酶活，三价阳离子比二价和一价阳离子对酶活有更好的促进作用；最大反应速度Vmax=0.955μmol•L-1•min-1；米氏常数Km=12.258（μmol/L）；此酶也可以降解其他不同类型的类胡萝卜素化合物；对微生物的营养特性进行了研究，确定了最佳培养基成分，该微生物的必需氨基酸为Arg 、Leu、Trp、Thr、Cys、Pro、Try；半必需氨基酸为Tyr；非必需氨基酸为Glu、Asp、Ile、Gly、 Val 、Ala、Ser、Met、Phe、Lys、His； K2HPO4和NaNO3是必需生长素，MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O和KCl是半必需营养素。.对该微生物的N段测序、酶蛋白的结构等研究虽然采取了多种方法和分析手段，都没有取得理想结果，无法进行基因克隆及表达研究。