胚胎期氯胺酮暴露对心脏发育及心脏神经嵴细胞迁移的影响及其分子机制研究

Drug abuse during pregnancy is an important risk factor that leads to the congenital heart disease and abnormality.In recent years, the abuse of ketamine in gestational period women is becoming more and more serious. Preliminary researches on Xenopus show that exposure to ketamine in early embryo can lead to cardiac enlargement, vascular thickening and abnormal neural crest cell migration .This project aims to the further use the model of Xenopus, to observe the effect of different concentration and time of ketamine exposure on the Xenopus embryo on their heart development; to explore the development of embryonic heart apparent appearance and histopathological changes; and the spatial variation of genes related to heart development and cardiac neural crest cell migration.This project involves using microinjection of Morpholinos(to inhibit NMDA gene from expressing) ,injection overexpression in vitro and transgenic technology to get a further understanding whether the effect of ketamine on heart development and the cardiac neural crest cell migration are dependent on NMDA receptors.We should have further study on how katamine affect cytoskeleton formation and result in delayed neural crest cell migration by NMDA receptor-mediated calcium signaling.This study has the original innovation. It will clarify the mechanism that ketamine exposure in embryonic period would lead to defects on offspring's heart development and provide a new theoretical basis for the early prevention of congenital heart disease in early pregnancy.

母孕期滥用药物是先天性心脏病发生的重要致畸因素。近年来，氯胺酮（"K"粉）在孕龄期妇女滥用情况日趋严重，母体滥用氯胺酮是否会造成子代心脏发育异常有待进一步研究。我们的前期研究发现：非洲爪蛙胚胎早期氯胺酮暴露后会引起爪蛙心脏扩大，血管增粗，伴有神经嵴细胞迁移异常。本项目拟进一步利用模式动物非洲爪蛙，观察不同浓度、时段氯胺酮暴露对非洲爪蛙胚胎心脏发育的影响，探索暴露关键时段；研究氯胺酮暴露下胚胎心脏发育的表观形态和组织病理学改变，及心脏发育相关基因与心脏神经嵴细胞迁移特异基因的时空变化。采用显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸阻抑NMDA 基因表达、体外注射过表达及转基因等技术，深入研究氯胺酮如何通过NMDA受体介导的钙信号，影响细胞骨架的形成，导致神经嵴细胞迁移障碍。本研究有源头创新性，将探讨胚胎期氯胺酮暴露致子代心脏发育缺陷的机制，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。

背景：氯胺酮，俗称“K粉”，是目前最流行的“俱乐部毒品”之一。流行病学调查显示，在氯胺酮的吸食者中，30%为女性，且大多小于27岁（正处于生育年龄）。因此，研究胚胎早期氯胺酮暴露对发育的影响至关重要。既往学者的研究主要集中在胚胎晚期氯胺酮暴露对神经系统的影响，而氯胺酮暴露于胚胎早期对心脏发育的影响的报道罕有。我们在前期研究中已发现氯胺酮对胚胎心脏有影响，但其引起心脏的具体形态结构和功能的改变，以及可能的机制，尚不明确。模式动物非洲爪蛙，常用于研究胚胎发育的机制及评估药物的致畸作用。它有产卵数量大、身体透明易观察等优点，并且与人类的器官发育及基因表达有很多共同点。因此，本课题拟用非洲爪蛙作为模式动物，探讨胚胎早期氯胺酮暴露对胚胎心脏发育的影响及其可能的分子机制。.主要研究内容：将爪蛙胚胎从第8期暴露于一定浓度的氯胺酮中至第21期。然后在胚胎发育后期①观察其整体表型的变化，以揭示氯胺酮对胚胎的致死性及致畸作用。②观察其心脏形态及超微结构的改变；并通过对心率及心室缩短分数（VSF）的统计分析，评估心脏功能的变化。③检测心脏细胞pH3蛋白表达的变化。④检测心脏发育相关基因，特别是XMLC2的mRNA及蛋白的表达变化。以阐述氯胺酮对胚胎心脏形态结构、功能及增殖情况的影响，并解释氯胺酮暴露导致心脏发育异常的可能机制。.主要结果：1.随氯胺酮暴露浓度的增加，胚胎死亡率逐渐升高。在0.125mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml氯胺酮浓度下，随着暴露浓度的增加，胚胎的体长逐渐缩短，心脏逐渐增大，并出现体轴弯曲的表型。提示胚胎的死亡率、体长缩短的程度具有浓度依赖性。2.当氯胺酮暴露浓度为0.5mg/ml时，胚胎出现以心脏增大为主的胚胎畸形。3.氯胺酮暴露后，胚胎心脏肌节结构改变，z线不完整。4.氯胺酮暴露后，胚胎心率减慢，心室缩短分数降低。提示氯胺酮可导致心脏功能障碍。5.氯胺酮暴露后，pH3蛋白的表达水平明显增加。提示心脏细胞增殖增加。6.氯胺酮暴露后，XMLC2 mRNA及蛋白的表达水平均下调。结合上述的表型，提示氯胺酮可能通过下调XMLC2 mRNA及蛋白的表达水平，从而导致心脏增大、心肌肌节结构损害及心脏功能障碍。.科学意义：目前的研究结果为我们日后探讨氯胺酮对哺乳动物胚胎心脏发育的影响打下了基础，也给早期氯胺酮暴露可能潜在的胎儿心脏缺陷及发生机制提供了参考。