低氧诱导因子2诱导Sirt6泛素化降解的分子机制及其在肝癌发生发展中的作用

Hypoxia is an important micro-environment of tumor growth. It is mainly regulated by hypoxia inducible factors (HIFs) to control the development of tumor. Recently, our study found that hypoxia can increase Sirt6 ubiquitination level through HIF-2alpha to inhibit the Sirt6 protein expression. On this basis, we intend to detect the Sirt6 ubiquitin E3 ligase or its deubiquitin enzyme under hypoxia condition by dual fluorescent protein reporter assay system, and further study the effect of HIF-2alpha down-regulates the expression of Sirt6 and its function in hepatocellular carcinoma. This work will provide important clues to know how hypoxia regulates cacinogenesis and tumor development, especially the function of HIF-2alpha and the post translation modification of Sirt6. It also may provide potential new targets for the hepatocellular carcinoma treatment.

低氧是肿瘤生存的重要微环境之一，它主要通过低氧诱导因子(HIFs)实现对肿瘤发生发展的调控。最近，我们的研究发现低氧微环境通过稳定HIF-2alpha蛋白，增加Sirtuin家族中的一个成员Sirt6的泛素化水平，进而促进Sirt6蛋白的降解。本课题拟在此基础上，通过我们已经建立的双荧光蛋白报告基因分析系统发现HIF-2alpha调控的，并诱导低氧下Sirt6降解的泛素E3连接酶或去泛素化酶，并进一步研究HIF-2alpha调控该酶表达和诱导Sirt6蛋白降解的分子机制及其在肝癌发生发展中的作用。这些研究工作将对认识低氧调控肿瘤发生发展的分子机制，尤其是HIF-2alpha和Sirt6及其翻译后修饰的功能具有重要价值，也可能为肝癌的治疗提供潜在的新靶点。

我们的研究发现低氧能够下调Sirt6的蛋白水平而不影响其mRNA的表达。通过siRNA技术将低氧下发挥重要作用的转录因子HIF-1a、HIF-2a以及HIF1b进行敲低后发现，HIF-2a和HIF1b介导了低氧对于Sirt6的调控。低氧和过表达 HIF-2a都能够缩短Sirt6蛋白的半衰期。同时，在分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、PS-341或溶酶体抑制剂CQ后发现Sirt6是通过蛋白酶体途径而非溶酶体途径发生降解的。另外， 我们通过Co-IP的方法发现低氧和过表达HIF-2a都可以使Sirt6的泛素化水平得到累积。为了筛选低氧下参与Sirt6降解的相关蛋白，我们成功构建了双荧光蛋白报告基因分析系统，选取了全基因组的CRISPR–Cas9 文库，通过高通量高内涵系统operetta读取EGFP和DsRed的荧光值，进而通过EGFP/DsR ed的荧光比值的变化，找到候选基因。另一方面，通过张健老师组发展的Allosite工具，发现SIRT6的一个潜在变构位点，继而利用虚拟筛选和荧光FPL方法获得两个可以微弱激活SIRT6的苗头化合物，经过系统的药物化学结构修饰获得先导化合物MDL-800。酶动力学揭示MDL-800是通过提高SIRT6对于底物亲和力及去乙酰化酶催化效率来发挥激动活性。MDL-800在HDAC家族的18个成员中对SIRT6具有很好的靶标选择性。利用结构生物学联合突变实验及大量生物物理方法，证实MDL-800作用于SIRT6上的一个全新变构位点并进一步确证了MDL-800是通过变构方式激活SIRT6去乙酰化酶活性而不影响SIRT6去长链酰化和ADP核糖转移酶活性。进一步发现MDL-800可以在肝癌细胞内特异性激活SIRT6组蛋白去乙酰化活性，下调H3K9Ac和H3K56Ac，阻断细胞周期阻滞从而抑制肝癌细胞增殖。在肝癌移植瘤动物及其敲除模型， MDL-800具有良好的在体特异性抑制肿瘤生长的效果。