miR-200a/b/429簇在胃癌EMT环路CTNNB1/ZEB/CDH中的协同调控机制的研究

上皮细胞间质转化(EMT)是肿瘤发生发展的重要机制之一。部分miRNA簇因其在基因组位置上与EMT重要基因相近，因而在肿瘤的转录调控机制中存在相同性。本课题依据同一染色体上miR-200a/b/429簇转录调控的协同作用拟进行"miR-200a/b/429簇在胃癌EMT环路CTNNB1/ZEB/CDH中的协同调控机制的研究"。本研究拟采用定量PCR、免疫组化和原位杂交方法确定80例胃癌标本及癌旁组织中miR-200a/b/429簇成员与CTNNB1、ZEB、CDH的表达特征；在细胞水平验证miR-200a/b/429簇对CTNNB1、ZEB、CDH的协同调控作用并应用分子生物学方法对胃癌EMT进行评价；通过测量裸鼠皮下移植瘤生长速度验证miR-200a/b/429簇对胃癌EMT调控与肿瘤生长的关系。本课题将为研究胃癌的发生发展机制、寻找以miRNA簇为对象的治疗靶标提供新思路。

上皮细胞间质转化是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。我们的前期研究已进行了基质金属蛋白酶（MMP-9）基因的表达对胃癌细胞侵袭与迁移的影响，在研究中发现miR-200a通过作用于CTNNB1调控胃癌细胞EMT过程。我们的研究表明miR-200家族调控胃癌EMT环路CTNNB1/ZEB/CDH的变化。主要集中在以下3方面。1，与正常胃粘膜组织相比，胃癌中miR-200a/b/c明显下调，WHOⅢ/Ⅳ级胃癌组织中miR-200a/b/c的表达低于WHOⅠ/Ⅱ级，ZEB1/ZEB2，N-caderin和β-catenin的表达明显上调，而E-cadherin的表达明显下调。miR-200a/b/c与ZEB1/ZEB2, N-cadherin和β-catenin呈负相关（P<0.05）,miR-200a/b/c与E-cadherin呈正相关（P<0.05），ZEB2蛋白与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期呈正相关，E-cadherin蛋白与肿瘤级别成负相关。2，为了进一步明确miR-200a的靶基因，我们用TOP/FOP荧光素酶检测β-catenin/TCF-4活性，发现miR-200a能下调β-catenin/TCF-4蛋白的表达水平，β-catenin的表达出现了细胞核向细胞浆的转移。miR-200a的表达能使N-cadherin，β-catenin，Twist1和Snail2表达水平下调，且使细胞周期出现G0/G1期阻滞，细胞的侵袭能力减弱，抑制了胃癌细胞EMT过程。3，miR-200a能调控Wnt/β-catenin信号通路的活性。我们发现胃癌中miR-200家族的表达依赖于表观遗传学的调控。ChIP实验结果显示DNMT1与miR-200a/b/429的启动子区结合，Co-IP实验显示DNMT1与EZH2两者有相互作用的关系。敲低EZH2不仅影响了H3K27me3的甲基化，而且影响了DNMT1在miR-200a/b/429启动子区的结合。敲低EZH2和DNMT1提高了miR-200a/b/429的表达。EZH2和DNMT1介导的对miR-200a/b/429的表观遗传学调控在胃癌的发生发展发挥了重要作用。总之，miR-200a/b/429通过调控CTNNB1/ZEB/CDH的表达抑制了胃癌细胞的生长增殖