手性扁桃酸人工生物合成途径的构建与调试

手性扁桃酸是一种目前由化石燃料制备的化学品，以可再生生物资源替代合成是减少对不可再生化石燃料依赖的发展方向，但自然界未发现直接合成手性扁桃酸的代谢途径。已知东方拟无枝酸菌对羟基扁桃酸合成酶可催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸， S-扁桃酸可以在天蓝色链霉菌对羟基扁桃酸氧化酶作用下转化为苯乙酮酸，苯乙酮酸又可经牧草红酵母D-扁桃酸脱氢酶催化为R-扁桃酸，而苯丙酮酸是L-苯丙氨酸合成代谢前体。我们拟将三种酶基因导入大肠杆菌，构建一条手性扁桃酸的人工生物合成途径。对这条手性扁桃酸的人工生物合成途径进行转录强度测定，酶活力及中间代谢物浓度分析等来确定代谢瓶颈。进而通过改变基因拷贝数剂量，调节代谢通路中控制基因表达的启动子及改造关键酶或限速酶的比活力或底物特异性等方法确定途径流量与代谢节点相关联的规律，为葡萄糖发酵生产手性扁桃酸及其衍生物确立理论基础。

手性扁桃酸是一种目前由化石燃料制备的化学品，以可再生生物资源替代合成是减少对不可再生化石燃料依赖的发展方向，但自然界未发现直接合成手性扁桃酸的代谢途径。已知东方拟无枝酸菌对羟基扁桃酸合酶可催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸，S-扁桃酸可在天蓝色链霉菌对羟基扁桃酸氧化酶作用下转化为苯乙酮酸，苯乙酮酸又可经牧草红酵母D-扁桃酸脱氢酶催化为R-扁桃酸，而苯丙酮酸是L-苯丙氨酸合成前体。我们通过对大肠杆菌遗传改造，结合以上三种酶，首次实现从葡萄糖出发分别进行S-扁桃酸和R-扁桃酸的发酵合成，24h内发酵产量分别达到0.74 g/L与0.68 g/L。通过对酶活力及中间代谢物浓度分析确定了对羟基扁桃酸合酶为限速酶，为了进一步提高其对苯丙酮酸的催化效率，我们采用半理性设计了73个单点饱和突变文库，HPLC分析筛选约7300个克隆后，我们获得3 个突变体蛋白对苯丙酮酸有约1.5倍酶活的提高。