大肠杆菌中人工合成体系构建高效脂肪酸合成途径的研究

基本信息
批准号:31170096
项目类别:面上项目
资助金额:63.00
负责人:刘天罡
学科分类:
依托单位:武汉大学
批准年份:2011
结题年份:2015
起止时间:2012-01-01 - 2015-12-31
项目状态: 已结题
项目参与者:钟晓芳,吴凯悦,马田,魏斌,高志
关键词:
代谢工程人工合成体系合成生物学脂肪酸合成生物制造
结项摘要

脂肪酸合成途径是人类利用"细胞工厂"进行"生物炼制"中的重要途径,利用该途径可以生产生物燃料(生物柴油、先进柴油)、生产精细化工原料(脂肪醇)、生产营养品(DHA不饱和脂肪酸)以及众多药物前体。但是微生物的脂肪酸合成途径在多个层面上被调控,以传统的代谢工程手段很难对脂肪酸合成途径进行进一步的提高。为了打破宿主对脂肪酸合成的严格调控,在本研究中,我们准备在大肠杆菌中用人工构建的脂肪酸合成途径去替代原有的代谢途径,从根本上打破细胞在转录水平对该系统的调控。我们还将利用体外实验的信息,对脂肪酸合成途径中各个酶的比例进行优化调整、对在蛋白水平上被调控的机理进行解析,并对相应被调控的酶进行改造,近而在大肠杆菌体内重新构建脂肪酸合成的人工合成体系,从而使该途径在生产效率和转化率上实现最佳化。

项目摘要

化石燃料的大量使用不仅仅造成全球气候变暖、环境恶化等问题,更重要的是能源危机愈演愈烈。近年来,利用微生物生产可再生能源受到了各方面的广泛关注。利用代谢工程改造微生物生产生物能源主要集中在生产短链醇,脂肪酸及其衍生物等。然而,由于对所研究代谢途径认识不够充分,依赖传统代谢工程或者高通量筛选技术进行的微生物代谢工程改造费时费力。我们课题组建立了脂肪酸合成途径的体外重建体系,通过系统的稳态动力学分析能快速获取脂肪酸合成途径中各个组分的贡献,进而指导定向改造工作。. 基于前期利用人工合成体系对脂肪酸代谢途径的研究,本课题在大肠杆菌中构建了高效脂肪酸合成途径。在大肠杆菌中过表达乙酰辅酶A羧化酶和硫酯酶能生产4.0 g/L的脂肪酸。为了进一步地提高脂肪酸的产量,本研究还建立了定量蛋白质组学的方法,以测量脂肪酸合成途径中各个蛋白质的绝对含量。通过分析比较各个蛋白表达的情况,联合脂肪酸合成途径体外重建研究的结果,对脂肪酸合成途径进行更为理性且更为精细的遗传改造。. 脂肪醇和脂肪酸酯都是先进的生物燃料,并且都可以通过改造脂肪酸代谢途径获得。本课题在高效脂肪酸合成途径的基础上,通过高表达WS/DGAT酶以联合2-酮酸途径生产脂肪酸短链酯。这是国际上首次利用WS/DGAT酶催化短链醇和脂酰辅酶A转酯化为可作为生物柴油的脂肪酸短链酯,其在大肠杆菌中产量为1008 mg/L。另外,为了提升生物柴油的低温流动性,本课题将支链氨基酸的合成途径引入到产生物柴油的菌株中,获得了异丁酯、异戊酯混合物,其产量为273 mg/L,占总酯产量的99%。该结果显示了微生物生产脂肪酸酯的潜能,创造了自然界中微生物体内不存在的新型化合物。. 利用人工合成体系不仅在大肠杆菌中取得了许多成果,本课题还其将用于酿酒酵母脂肪酸合成系统的研究,通过体外重建系统确定了该途径的主要限速步骤为脂肪酸合成的起始步骤。随后通过高精度的质谱分析确定了该蛋白的翻译后磷酸化修饰位点,为进一步改造脂肪酸代谢途径提供了靶点。. 另外,本课题还在毕赤酵母中探索了脂肪酸和脂肪醇的过量生产,首次通过在毕赤酵母中外源表达来源于霍霍巴的脂肪酰-CoA还原酶Jojoba FAR合成脂肪醇。该工作为利用毕赤酵母生产脂肪醇奠定了基础,为工业生物合成专一性链长的脂肪醇提供了新途径。

项目成果
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数据更新时间:2023-05-31

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