扁桃酸在人和大鼠的立体选择性代谢和手性转化机理研究

本项目在前期研究工作的基础上，综合应用手性色谱学、药物代谢学、细胞与分子生物学、化学等方法与技术，在重组酶、亚细胞器、组织等多个水平，重点研究扁桃酸通过MDH催化的在大鼠和人的立体选择性代谢和通过形成辅酶A-硫酯的扁桃酸手性转化机理和人鼠差异，深入了解其体内代谢途径、手性转化部位和手性转化程度等。主要应用人和大鼠的重组MDH，在分子水平阐明扁桃酸在大鼠和人立体选择性代谢机理；通过化学合成S-扁桃酸和R-扁桃酸辅酶A硫酯，阐明扁桃酸在哺乳类动物中的手性转化机理和人鼠差异。研究成果将有助于丰富扁桃酸立体选择性代谢与手性转化代谢的理论，为设计高效低毒新药和临床合理用药提供参考。另外，由于扁桃酸是评价环境污染物苯乙烯危害人体的标志物，所以本研究还可以深入理解苯乙烯立体选择性代谢和毒理学，指导苯乙烯职业病预防与治疗工作。

本课题的目的是为了从重组酶、亚细胞器、组织等多层次，确定大鼠中S-扁桃酸手性转化发生的部位，阐明其手性转化机制。研究结果表明，扁桃酸在大鼠肝、肾S9及肝线粒体、胞浆蛋白都能发生代谢，在肠道菌群中不发生代谢。苹果酸脱氢酶的抑制剂草酰乙酸、L-苹果酸和L-2-羟酸氧化酶的抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠、盐酸羟胺、肉桂酸、草酸对L-扁桃酸在各部分中的代谢有抑制作用，但商品化的人胞浆苹果酸脱氢酶对L-扁桃酸没有代谢。本研究成功克隆表达了人和大鼠L-2-羟酸氧化酶同工酶B，所得的重组酶纯度高、活性好，其对扁桃酸及类似物的酶动力学特征表现出了一定的种属差异。人HAOX2对L-苯乳酸的催化效率最高，其次是S-2-氯扁桃酸，最后是L-扁桃酸。而大鼠LCHAO对这些底物的催化效率却恰好相反。 这可能是由人和大鼠L-2-羟酸氧化酶同工酶B结构中活性位点氨基酸残基的不同以及环4的差异导致。本研究进一步成功合成S-MA-CoA硫酯，MS初步检测显示有m/z 900（[MA-CoA-H]-）的分子离子峰，二级质谱对m/z 100～950范围的离子进行全扫描显示m/z 900母离子的子离子峰除m/z 766（[CoA-H]-）峰外，其他的子离子和CoA的子离子碎片峰完全一致，主要有m/z 686、408、338、159、134等，表明合成的化合物为目标化合物，并成功纯化。在大鼠肝匀浆中水解产生R-MA，由此推断MA的手性转化机制应该与洛芬类手性转化机制相同：S-MA在体内优先生成S-MA-CoA硫酯，然后发生脱质子和重新质子化的差向立体异构化，转化为R-MA-CoA硫酯，再水解产生R-MA。该研究深化了手性药物构型转化机制的认识，为设计高效低毒新药和临床合理用药，指导苯乙烯职业病防治提供科学和实验依据。