炭疽杆菌芽胞萌发机制研究

Bacillus anthracis infection would only be in the form of spores which germinated into vegetative cell and resulted in anthrax after entranced into a host. Therefore, the dormant spore germination of B. anthracis is the first crucial step in the restoring outgrowth. The recent researches on germination were mostly focused on the model organism Bacillus subtilis, but differences of germination between B.anthracis and B.subtilis apparently exit. The researches on germination B.anthracis spores were relatively thorough. In this study, quantitative proteomic methods will be used for scanning the key proteins during the germination of B. anthracis A16R. Parallel reaction detection (PRM), reverse transcription qPCR and the fusion reporter system will be used to verify differential expression genes. And deleted mutant strains would be constructed to analyze their effect on germination. The research on the proteome of germination is expected to describe the molecular mechanism of germination, depict the regulatory network, and determine the main regulatory factors during germination. The study will provide further investigation of the mechanisms by which B. anthracis spores infect hosts and offer new targets for the development of vaccines and therapies for anthrax. It will also give a reference for other microorganisms.

芽胞是炭疽传播感染的唯一形式，侵染宿主后开始萌发引发疾病。作为芽胞休眠体恢复生长的关键步骤，目前有关芽胞萌发的研究主要针对模式生物——枯草芽胞杆菌，但两者有较大差异，而炭疽杆菌芽胞萌发的研究缺乏系统性。本研究拟利用定量蛋白组学标记技术针对炭疽杆菌A16R芽胞萌发时期的蛋白样品进行定量比较分析，筛选萌发过程中的关键蛋白，同时结合质谱平行反应检测技术（PRM）、反转录qPCR和融合报告基因系统对差异蛋白进行验证，并构建差异基因缺失突变株，分析其对芽胞萌发的影响。通过研究芽胞萌发阶段蛋白质组的变化初步阐述芽胞萌发的分子机制，描绘萌发阶段的调控网络，确定萌发过程中的关键调控因子。本研究将为发现针对芽胞萌发的药物靶标奠定良好的基础，同时对其他微生物生理过程的相关研究提供借鉴意义。

芽胞萌发是炭疽杆菌致病的关键过程，解析芽胞的萌发过程及发掘萌发中发挥关键作用的蛋白质，设计阻断该进程将是炭疽防治的最为有效手段之一。目前炭疽杆菌芽胞萌发的研究主要聚焦于单个萌发受体功能的探究，本研究借助蛋白质组学的手段发现，萌发过程主要发生戊糖磷酸、氧化磷酸化活动，参与应激反应的蛋白（BA_2262、SodA）、水解酶类(BA_4368)蛋白上调，小酸溶蛋白和芽胞结构蛋白被降解。芽胞折光性再降低，芽胞丧失休眠特性。通过实时定量PCR、重组质粒表达以及多克隆抗体WB分析，确定蛋白BA_2262、AbrB、BA_4499和BA_4368在萌发过程中翻译水平上调，与蛋白质组学分析结果一致。这结果说明了萌发过程中发生转录翻译。.基因功能探究方面发现，分子伴侣BA_2262缺失后加快了炭疽杆菌芽胞萌发，聚集萌发受体的蛋白gerD缺失后炭疽杆菌芽胞萌发速率减慢显著，攻毒后小鼠存活时间延长。gerE基因不影响芽胞形成，缺失gerE基因后芽胞萌发减慢，与GerD蛋白无关，不同于枯草芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌，gerE基因缺失株芽胞对小鼠毒性增强。电镜分析芽胞结构发现，gerE基因缺失株缺少明显的芽胞外被和外胞子囊，无法长时间耐受生理盐水的渗透压。质谱与WB分析发现gerE基因缺失株中BA_5640和BA5641这对顺反子下调，它们可能与芽胞萌发有关，ΔgerE萌发速率减慢可以通过BA_5640和BA_5641的表达进行部分回补。BA_5640、BA_5641与GerE之间的调控关系还需要进一步探究。萌发速率减慢逃逸宿主免疫可能是毒力增强的主要原因。多效调控因子SpoVG影响芽胞形成，缺失后细菌不进入芽胞形成过程，也与SpoIIE相关。不同于枯草芽胞杆菌，补偿枯草杆菌的SpoIIB蛋白，芽胞形成依然受阻。spoIIID缺失后与细菌胞外蛋白酶活性有关的BA_1288表达量上调,增强了细菌对小鼠的毒力，毒力蛋白未受影响，推测表面金属蛋白酶在芽胞形成缺陷时作为关键毒力因子。这些新的发现能给芽胞萌发过程的探究提供坚实的基础。