福氏志贺氏菌多糖结合疫苗的体内生物合成研究

In contrast to isolated　bacterial polysaccharides, conjugate vaccines induce a　long-lasting　T-lymphocyte dependent immunological　memory . Efficacy and safety of conjugate vaccines　have been proven for several examples．State-of-the art production of conjugate　vaccines，in which polysaccharide antigens are covalently linked to carrier proteins using chemical methods，is a laborious,multi-step process.In recent years several protein oligosaccharyl- transferases have been identified in bacteria, which makes it possible to produce polysaccharide-protein conjugates in a prokaryotic expression host. Forthermore, a desirable vaccine against Shigella flexneri is urgent now. Therefore, in this study we plan to construct an engineering Shigella strain to produce the new polysaccharide-protein conjugate vaccine. Firstly, a Shigella flexneri mutant, in which its large virulence-plasmid is cured and the synthsis of lipopolysaccharide is broken, will be constructed. Then the N-linked glycosylation system of Campylobacter jejuni and the O-linked glycosylation system of Neisseria meningitides will be transferred into this mutant,respectively. A new kind of glycoproteins would be produced since the O-antigen polysaccharides will be in vivo conjugated to the carrier proteins by the above foreign-introduced oligosaccharidetransferases. At last the immunogenicity and effectiveness of the new glycoproteins will be evaluated. The described methodologies in this study will constitute an important step towards cost-effective in vivo production of conjugate vaccines, which in future may be used for combating severe infectious diseases, particularly in developing countries.

多糖结合疫苗由于能同时诱发机体非T细胞依赖和T细胞依赖的免疫反应，产生长久的免疫保护作用，作为新一代疫苗近年来越来越受到重视并在多种病原菌预防疫苗研制中得到应用。但是，目前经典的结合疫苗生产方式是通过化学交联的方式在体外将多糖抗原与载体蛋白结合在一起。这是一种步骤繁多、耗能较大而得率较低的生产模式。近年来多种细菌蛋白糖基转移酶的发现，为结合疫苗的体内生物合成带来了极大的希望。另外，由于目前仍无理想的痢疾疫苗。因此，本研究拟首先通过构建无毒的志贺氏菌突变株并阻断其脂多糖的合成，再分别将空肠弯曲杆菌的N-糖基化系统和脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系统转入该菌株，在菌体内通过上述外源导入的糖基转移酶将Ｏ－抗原多糖转移至不同的载体蛋白上，从而生成一类全新的糖蛋白，并进一步评价其免疫原性和保护效果，为新一代绿色环保多糖结合疫苗的研制打下基础。

多糖结合疫苗是将多糖共价连接到载体蛋白，使多糖抗原（T细胞非依赖抗原）转换为了T细胞依赖抗原，从而能够激发体液免疫。目前市场上的多糖结合疫苗主要是利用化学法生产，需要多次纯化，收率较低，生产成本大大提高，很难在发展中国家及贫穷国家普及。随着合成生物学的发展以及细菌蛋白糖基化的发现，使得利用生物法生产多糖结合疫苗成为了可能。 . 本研究利用来自脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系统中的糖基转移酶PglL（几乎可以催化所有的糖），首先通过直接将外源的O-糖基转移酶PglL及其天然底物蛋白PilE的表达载体转入O-抗原连接酶缺失的志贺氏菌301DWP中，成功实现PilE糖基化。之后，将载体蛋白替换为市场上常用的rEPA、TTc及CTB，通过蛋白免疫印迹（WB）检测，同样能够获得较高的糖基化水平；同时发现底物蛋白融合两个糖基化位点时，WB结果中可以检测到两个集中的糖基化条带。通过纯化得到高纯度糖蛋白并免疫小鼠，可激发以IgG1占主导的体液免疫，并且CTB为底物蛋白时免疫效果最好。体外杀菌实验表明抗体具有较高杀菌活性，攻毒实验表明CTB作为底物蛋白时具有很好的保护效果。在上述基础上我们进一步对糖基转移酶PglL的O-糖基化位点进行了研究。将由29个氨基酸组成的糖基化位点序列缩短并优化，最终我们得到了PglL催化的O-糖基化修饰位点的共有序列为WPXnSXmP，其中Xn和Xm为可变的柔性氨基酸，而最优的序列为WPAAASAP，并命名为MOOR。为下一代多糖结合疫苗的精确设计打下了基础。. 目前尚未有利用O-糖基化生产多糖结合疫苗的报道，我们的研究首次利用O-糖基化生产多糖结合疫苗，并取得了成功，并对糖基化位点在原有的29个氨基酸序列的基础上，得到了只包含8个甚至更少的氨基酸的识别序列，填补了相关理论空白并对疫苗进一步优化奠定了基础。与化学法相比较，生物法生产的多糖结合疫苗更加精细、可控，产品具有很好的均一性。我们使用O-糖基化制备多糖结合疫苗的方法扩展了糖工程在多糖结合疫苗研究中的应用，为生产多糖结合疫苗开辟了新的途径。