炭疽杆菌A16R芽胞蛋白质基因组学研究

Proteogenomics, based on the MS/MS technique, has become an important basis for the genome annotations in prokaryotes. However, subject to the difficultis of spore protein preparation, B.anthracis spores proteomics research is not deep enough and lots of spore protein components are undefined. In this study, high coverage mass spectrometry technique will be applied to spore proteomics research and proteogenomics Analysis of B.anthracis A16R in order to find new peptide and genes which expressed in the spore. Further, the function of new genes will be identified preliminarily, and the genome annotation will be complemented using proteogenomics data. This project will not only help to determine all the spore proteins, identify new genes and complete the B.anthracis “omics” database, but also conducive to analyze the pathogenesis of anthrax, develop the vaccine and treatment methods.

蛋白质基因组学以串联质谱技术为核心，已成为原核生物基因组注释和重注释的重要依据。但受炭疽杆菌芽胞蛋白制备的不易等因素制约，目前炭疽芽胞蛋白质组学研究开展较少，对炭疽芽胞蛋白组成及功能的了解匮乏。本研究拟采用高覆盖质谱技术对炭疽杆菌疫苗株A16R芽胞进行蛋白质组学研究和蛋白质基因组学分析，挖掘芽胞中表达的新基因，初步验证其功能，补充和完善炭疽杆菌基因组注释。本项目不仅能在蛋白质组水平上全面了解芽胞的蛋白组分，完善炭疽杆菌组学数据库，还可以推动在芽胞中特异表达的新基因的发现。这将为我们深入解析炭疽芽胞杆菌致病机制，研究炭疽芽胞杆菌疫苗，开发炭疽病治疗的新方法等深入研究奠定良好的基础。

本研究首先通过高精度蛋白质组学，研究了炭疽芽胞杆菌休眠期芽胞的全菌蛋白组情况，在繁殖体蛋白质组数据库的基础上进一步建立了炭疽芽胞杆菌全蛋白组数据库。与此同时，通过新兴的蛋白质基因组学分析，发现了现有基因组存在的测序错误及其所导致的注释问题，发现了一部分已有注释的翻译起始位点的注释错误和新基因并进行了验证。芽胞蛋白样品共鉴定到3874个蛋白，其中染色体编码蛋白3782个，pXO1质粒编码蛋白92个。覆盖率达到67.8%。综合繁殖体和芽胞的鉴定结果，共鉴定4525个蛋白，覆盖率提升到79.2%（4525/5711），实现了比较高的覆盖率。 . 从质谱结果中发现两个芽胞形成时期表达的肽段BA_54287和BA_13631，对它们的表达时相、细胞定位，上游调控因子等进行详细的分析。结果表明，BA_54287在芽胞形成的初期阶段表达，最终定位在前芽胞中，可能受到spoVG基因的调控。BA_13631表达时相是在芽胞形成的stageIII（胞吞）时期，并且是只在芽胞中特异性表达的基因，定位在芽胞表面，可能受spoVG和sigF的双重调控。. 由于是通过蛋白质基因组学的方法得到的新肽段，新基因BA_54287和BA_13631没有已知功能的蛋白结构域。对新基因的功能进行了包括胞外蛋白酶，过氧化氢抗性，热抗性，芽胞形成率，芽胞萌发率，毒力的功能研究通过基因敲除的方法。结果显示，BA_54287和BA_13631的缺失对炭疽芽胞杆菌的胞外蛋白酶，过氧化氢抗性，热抗性等没有显著影响。BA_54287缺失后芽胞形成率有小幅度的下降，丙氨酸途径的芽胞萌发有微弱的下降（无显著差异），对炭疽杆菌毒力无显著影响。BA_13631缺失后，对芽胞形成率没有显著影响，在L-丙氨酸与L-脯氨酸组成的AEA萌发通路中萌发速率明显减慢，炭疽杆菌毒力明显下降。. 此外对发现的新肽段的调控研究中发现spovG基因对芽胞形成非常重要。spoVG基因在炭疽芽胞杆菌中缺失之后，芽胞形成具有缺陷，不能形成成熟的芽胞。这与芽胞形成研究的模式生物枯草芽孢杆菌有明显的不同，对炭疽芽胞杆菌的芽胞形成机制是一个重要补充。