真菌非核糖体多肽合成酶中CT结构域催化产物释放和大环环化的分子机制研究

There are many natural products with novel chemical structures and obvious biochemical activities in fungi, which enables it very suitable for discovering new drugs or lead compounds. The NRPS biosynthetic pathway in fungi uses a condensation-like (CT) domain to control the product release and macrocyclization reaction. In contrast to the thioesterase (TE) domain in bacteria, the CT domain need to tether to the natural T-domain for efficient catalysis. We aim to solve the crystal structures of TqaA-CT in fumiqunazoline F biosynthesis and EcdA-CT in echinocandin B biosynthesis by collaboration with Professor Yi Tang at UCLA. We also plan to determine the complex structures of TqaA-CT/TqaA-T and TqaA with its inhibitors. We hope to combine the structural information, mutagenesis data, and molecular dynamics caculations to elucidate the molecular mechanism of how the fungal CT domain catalyzed the reaction of linear peptidyl precusor release and macrocyclization. Understanding the role of the CT domain in fungal NRPS will not only broaden our knowledge in bacterial and fungi biosynthesis, but also provide essential information for promoting fugi combinatorial biosynthesis.

真菌中蕴藏着丰富的结构新颖和具有显著生物活性的天然产物，非常适合于新药和先导化合物的发现。真菌NRPS生物合成途径通过CT功能域催化控制产物释放和大环环合反应，与细菌来源的TE功能域不同的是，CT功能域需要结合特异性的T功能域后才能进行催化反应。本项目拟与美国加州洛杉矶分校的唐奕教授展开合作，希望能够解析出三环肽生物碱fumiquinazoline F生物合成途径中的TqaA-CT和六环肽天然产物棘白菌素B生物合成途径中的EcdA-CT的晶体结构，同时测定出TqaA-CT/TqaA-T复合物和TqaA-CT/小分子抑制剂复合物的晶体结构，结合突变体测活、分子动力学计算等手段揭示出真菌生物合成途径非核糖体肽合成酶中CT催化线性肽酰前体的释放和大环环化反应的分子机理。通过本项目实施，将会在分子水平上帮助我们深入理解细菌和真菌生物合成机制的差异，也可以为促进真菌组合生物合成提供良好的理论基础。

真菌非核糖体肽合酶能够生物合成包括青霉素、环孢素和棘白菌素在内的多种重要药物分子。细菌非核糖体肽合酶使用C末端的硫酯酶及其中一个亲核性的丝氨酸来实现生物合成产物的环化，而许多真菌非核糖体肽则通过C末端的与C功能域相似的CT功能域来生产环肽产物。根据报道CT功能域必须与上游的T功能域发生蛋白-蛋白相互作用才能发挥出催化功能。尽管近年来已有不少的细菌C功能域和硫酯酶TE功能域的结构陆续被解析出来，如果能够解析出CT的晶体结构，将有助于我们研究清楚细菌和真菌非核糖体肽合酶催化大环环合反应的不同机制。为了区分出CT功能域和普通C功能域的功能差异，我们首先通过截短、突变以及酶与过渡态类似物共结晶的方法获得了高衍射质量的TqaA CT的晶体。CT的晶体结构表明CT与C功能域非常相似，最大的差异是C功能域的N端环区结构被CT功能域的一段特征 α1螺旋所取代，这一构象及拓扑学上的差异导致C功能域靠近受体一侧的两个亚结构域变得紧密，并挡住溶剂通道。这一结构特征与CT的催化性质完全吻合，即给体底物的大环环化不再需要下游的受体底物。进一步为了研究CT功能域与T功能域的特征相互作用，我们纯化了共价结合了磷酸泛酰巯基的T-CT复合物，利用分子置换方法解析出2.49埃的晶体结构。该结构显示磷酸泛酰巯基分子与CT功能域结构中的T3870、N3890、N3899以及Y3945形成广泛的氢键相互作用网络，解释了CT功能域为什么更青睐于结合了肽基底物的T功能域而不是链接了SNAC的底物。磷酸泛酰巯基将参与稳定T与CT的相互作用，并从CT功能域活性口袋的一侧接纳线状多肽产物，完成最终环状多肽产物的合成与释放。T-CT的活化态复合物晶体结构揭示一旦活化了的T功能域接近CT功能域，将与环区2（氨基酸残基3862-3869）、环区3（氨基酸残基3902-3907）相互作用。我们的研究结果不仅解释了真菌NRPS中CT功能域为何必须依赖T功能域才发挥作用，也为通过合理设计来产生不同大小与结构的新型大环多肽天然产物提供了技术蓝图。