苯二酚内酯组合生物合成中硫酯酶结构域控制产物释放形式的分子机制

Combinatorial biosynthesis is a highly effective way to expand the structural diversity of natural chemical drug leads, and have attracted a lot of attention over the past two decades. The thioesterase (TE) domain of iterative polyketide synthase plays a pivotal role in controlling the product release pattern during the combinatorial biosynthesis of benzenediol lactones (BDLs). The functional diversity of the TE domain directly determines the structural diversity of the final product. However, the molecular mechanism of TE-BDLs in controlling product release pattern remains cryptic. Based on the discovery of two homologous, yet functionally divergent TE-BDLs, this project aims to identify the key polypeptide fragments and key amino acids of TE-BDLs which control the product release pattern, and subsequently reveal the underlying catalytic molecular mechanism by means of protein homology modeling, amino acid sequence alignment and analysis, polypeptide fragment swap, protein-substrate molecular docking simulation, site-directed mutagenesis, product analysis and structure identification, etc. The implementation of this project may provide new modules for the diversity-oriented combinatorial biosynthesis of benzenediol lactones, and offer a practical example for the engineering design and remodeling of fungal iterative polyketide synthase.

组合生物合成是拓展天然药物先导化合物结构多样性的重要方法，是近年来次生代谢产物生物合成领域的研究热点。在苯二酚内酯类化合物的组合生物合成中，聚酮合酶的硫酯酶结构域对终产物的释放形式具有关键的控制作用。其催化功能的多样性直接决定着产物化学结构的多样性。但是苯二酚内酯聚酮合酶硫酯酶结构域控制产物释放形式的分子机制目前仍不清楚。本项目拟选取前期研究发现的两种氨基酸序列高度相似，但催化功能有明显差异的苯二酚内酯聚酮合酶硫酯酶结构域为研究对象，运用蛋白质同源建模、氨基酸序列比对分析、多肽片段交换、蛋白-底物分子对接模拟、氨基酸定点突变、产物分析检测与结构鉴定等技术手段，明确硫酯酶结构域中控制产物释放形式的关键多肽片段和关键氨基酸位点，阐明硫酯酶结构域控制产物释放形式的分子机制。本项目的实施能为以结构多样性为导向的苯二酚内酯组合生物合成提供新元件，也为工程化设计和改造其他真菌聚酮合酶提供借鉴。

聚酮合酶的硫酯酶（thioesterase，TE）结构域在聚酮类天然产物生物合成中负责终产物的释放。TE结构域的催化活性和选择性决定着聚酮产物的合成产率和化学结构。本项目通过蛋白质同源建模、氨基酸序列比对分析、蛋白-底物分子对接模拟等技术手段解析了苯二酚内酯合成酶TE结构域的三维结构和蛋白-底物互作方式；随后，通过多肽片段交换、氨基酸定点突变等技术手段构建了56种TE结构域重组或突变的苯二酚内酯合成酶，明确了TE结构域中控制产物释放形式的关键多肽片段和氨基酸位点，从而揭示了苯二酚内酯组合生物合成中TE结构域控制产物释放形式的分子机制；最后，利用组合生物合成技术，结合产物分离纯化和结构鉴定等天然有机化学手段，获得了23种新型“非天然”苯二酚内酯及其结构类似物。研究结果将为工程化改造真菌聚酮合酶，组合生物合成新型聚酮类药物分子提供理论基础。项目执行过程中培养博士研究生1名，发表SCI收录学术论文3篇，授权发明专利1项。项目负责人在中国生物工程学会第五届青年科技论坛分会报告中汇报了相关成果。