先天性视网膜劈裂鼠动物模型制备及RS1基因干预治疗的实验研究

运用基因打靶技术，将Ｘ-性连锁遗传性视网膜劈裂症（XLRS）突变基因（RS1）与鼠胚胎干细胞（ES）结合，敲除RS1基因外显子1（exon 1），建立Rs1h基因敲除鼠疾病模型，不仅可对RS基因功能及突变机制进行深入研究，而且为XLRS基因干预治疗提供宝贵动物模型。制备AAV(2/2)-CMV-Rs1h载体，补充本病因基因突变导致的RS1蛋白缺失或功能缺乏，为XLRS基因治疗提供可能和条件。将AAV(2/2)-CMV-Rs1h载体，分别于早期（生后2周）,中期（2个月），晚期（7个月）经由玻璃体腔注入，对XLRS进行基因干预治疗。观测其不仅对幼鼠，而且对成年鼠的可能治疗作用，开创出一条新的可行治疗XLRS的方法和手段。经大量体内外实验，有望最终在临床上实现对这一疑难性家族遗传性疾病的根本治疗。具有十分深刻的科研价值和潜在巨大的经济效益和社会意义。

先天性视网膜劈裂症，是XLRS1基因突变导致的一种典型遗传性眼病。由于XLRS的发生具有明确的基因突变的遗传基础。因此，基因治疗，或在基因水平上的干预治疗成为实现对该病根本治疗的方法和途径。我们对国人XLRS家系及患者进行了基因突变的检测与分析，并对RS患者进行局部多佐胺治疗，探讨疗效、基因表型、临床表型的相关性。根据国人RS1基因突变类型，制备RS小鼠模型，AAV(2/2)-CMV-Rs1h注入RS模型小鼠玻璃体腔，观测其治疗小鼠RS的效果和安全性，观察研究XLRS基因干预治疗的有效性，安全性，可靠性及可行性，并探讨可能的治疗机制。.本项目研究内容和研究目标按照申请书圆满执行完成，并得到以下研究成果：.①在国人先天视网膜劈裂患者及家系，新发现11种RS1基因突变，在国际上新发现了4种RS1基因突变，其中有3种新突变集中于外显子5的145-163位，即发现国人RS突变的独特区域和热点突变，并发现一种新的非疾病相关多态性。相关论文已发表于JJO，中华眼底病，中华实验眼科杂志等杂志。.②在国人先天视网膜劈裂患者及家系，发现了临床表现为严重型RS的相关基因突变位点和突变类型，发现XLRS的临床表现与基因突变类型及突变位点具有一定的相关性，并发现家系内同一突变的XLRS临床表现的多样性，和发现同一突变不同家系的临床表现的多样性。相关论文已发表于 Mol Vis, 中华实验眼科杂志等杂志。.③根据国人基因突变成功构建RS小鼠模型，含有Rs1h cDNA的pCR-Rs1h 质粒及AAV(2/2)-CMV-Rs1h 载体，经玻璃体腔注射，发现小鼠RS1蛋白表达增强以及电生理检测ERG b波明显改善，且治疗效果幼鼠好于成年鼠，且未发现不良反应。相关论文已投IOVS，处于修回阶段。.④局部应用多佐胺治疗RS患者，随访6个月，OCT发现黄斑水肿明显减轻，最佳矫正视力改善，但多佐胺疗效与基因突变类型或临床表现型均无相关性。相关论文已投Cur Eye Res，处于修改及补充阶段。.本项目研究的部分结果已完成成果鉴定，拟申报大连市、辽宁省科技进步奖，并于国际和国内会议上作研究报告，在国内多家医院眼科，如北京同仁医院眼科中心，北京大学人民医院眼科等进行了成果推广。培养博士研究生3名、硕士研究生6名，中青年学术带头人1名等。