三维多孔微载体/肝细胞复合体低温保存的关键问题

The emergence of tissue engineering has created the need for the long term cryopreservation techniques to store tissue-engineered products.The various injury models in cryopreservation process,such as solute injury,chilling,cold shock and intracellular ice formation, have been exploring by the scientists. Whereas there exists a special issue for tissue engineered products as bioartificial liver, that is, the cells attach on the surface of the matrix. The attachments (vinculin) may be broken in the cooling or warming process because of the difeerence of coefficient of thermal expansion between cells and matrix. To our knowledge, there is no research was reported on this problem. Based on the experimental and mathematical calculation results, this study will investigate the mechanism of cell detachment. A viscouselastic Kelvin model will be setup to calculate the mechanical stress of cells in the cryopreservation process. The experimental and calculated results will be compared to find an effective method to reduce the detachment rate of cells. The results of this study will provide therotical and technical support for the cropreservation of engineered-tissues/organs.

组织工程化组织和器官的商业化生产，迫切需要人们寻求其长期有效的保存方法，以便满足不同地区病人的需要。针对低温保存过程中细胞可能受到的各种损伤，如溶液损伤、冷害、冷冲击、胞内冰等，国内外学者已进行了较深入的研究工作。但对于类似多孔微载体/肝细胞复合体这样的人工组，存在一个特殊问题，即细胞与支架之间的连接，可能由于细胞与支架材料的热膨胀系数不同，造成细胞粘附点的断裂，使细胞从支架材料上脱落、甚至死亡。目前针对这一问题的深入研究还未见报道。本研究将通过理论分析、实验与数学模型计算相结合的方法，探索热膨胀系数引起的细胞脱落、死亡机理。将建立粘弹性(Kelvin)模型计算粘附细胞在玻璃化保存、低温冻结保存时受到的机械应力，与实验结果对照分析，寻找降低脱落、死亡率的有效方法。研究结果对于实现人工组织、器官的低温保存有较重要的指导意义。

组织工程化组织和器官的商业化生产，迫切需要人们寻求其长期有效的保存方法，以便满足不同地区病人的需要。多孔微载体/肝细胞复合体是一种肝细胞粘附在多孔微载体上的结构，要成功保存该复合体，解决肝细胞与微载体之间的粘附问题是关键问题之一。本课题针对该问题开展研究工作，通过理论分析、实验与数学模型计算相结合的方法，探索热膨胀系数引起的细胞脱落、死亡机理，研究结果对于实现人工组织、器官的低温保存有较重要的指导意义。经过四年的深入研究，取得以下主要进展和重要结果：1、以天然材料壳聚糖为原材料，制备生物人工肝支持系统中所需要的三维多孔微载体，从三维多孔微载体制备工艺的创新性入手，成功的探索出一套采用高压脉冲微胶囊成型仪制备微球并结合冷冻干燥处理制备壳聚糖三维多孔微载体的新工艺。2、用图像测量分析法，利用低温显微镜拍摄了低温保存过程中细胞及微载体的面积、体积变化，探索了一种细胞及微载体热膨胀系数的测量方法。3、获得了三维多孔微载体/肝细胞复合体低温保存的工艺。通过测量保护剂对细胞的毒性，研究了保护剂加载方法，研究了降温速率和保护剂种类对肝细胞复合体玻璃化低温保存的影响。4、分析了低温保存过程中冰晶成核、胞内冰形成机理，以及控制冰晶的方法。胞内冰是造成细胞损伤的主要因素之一，影响胞内冰形成的因素包括降温速率，细胞对水分的渗透能力，细胞膜完整性，胞外冰以及低温保护剂等。在此基础上，研究并申请了系列肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法的专利。5、应用分子动力学方法，在分子水平上研究了低温保护剂对冰晶生长的抑制机理。研究结果将有助于更好地了理解保护剂对冰晶生长的抑制机理，为优化肝细胞三维多孔载体的保存提供理论支持。6、探索了肝细胞复合体在低温保存过程中热膨胀损伤机理，为微载体-肝细胞复合体及类似组织的低温保存提供了有力的技术参考。