院内艰难梭菌感染（CDI）快速一体化检测技术的研究

In recent years, Clostridium difficile infection (CDI) with the abuse of human antibiotics has become increasingly popular and serious, but there are no diagnostic methods with better sensitive, specificity, short turnaround time, low-demand technology at present, the development of a simple, fast and accurate CDI diagnosis new methods has significant clinical significance and practical needs. Nucleic acid testing for multiple and integrated detection of C. diff in clinical fecal samples is the main trend, but some factors like the complex process The development of a simple, fast and accurate new method for CDI diagnosis has significant clinical significance and practical needs. Nucleic acid testing for multiple and integrated detection of C. diff in clinical fecal samples is the main trend, but some factors like the complex process of the fecal samples, low nucleic acid purification efficiency, convergence of the upstream (nucleic acid extraction) and downstream (amplification and detection), and contamination problems restrict its application in clinical bioassays. In order to solve these problems, this project aims to establish rapid processing of fecal samples, optimize the process of nucleic acid extraction of fecal samples and real-time fluorescence multiplex PCR, and integrate and automate the whole process. At the same time, according to the integrated detection process, an integrated and closed cartridge is designed and processed by 3D printing technology iteratively. The whole detection process is completed in the cartridge to realize the C. diff multi-integration detection from the sample input to answer output. Finally, the performance of the entire system was assessed by the actual detection of clinical fecal samples.

近年来，艰难梭菌感染（CDI）伴随着抗生素的滥用变得愈发盛行和严重，但是由于目前尚无一种敏感性、特异性较好，周转时间短、技术要求不高的诊断方法，故发展一种简易、快速、准确的CDI诊断技术具有重大的临床意义及现实需求。对临床的粪便样本采用核酸检测方法对艰难梭菌进行多重一体化检测是当前主要趋势，但是粪便样本处理过程复杂，核酸纯化效率不高，上游的核酸提取和下游的扩增检测的衔接，以及污染等问题是制约其在临床广泛应用的主要因素。本项目针对这些问题，拟通过建立粪便样本的快速处理流程，优化磁珠法粪便样本核酸提取和实时荧光多重PCR检测流程，使整个流程一体化和自动化；同时根据检测流程，设计新型的一体化封闭式检测卡盒，采用3D打印技术对其进行迭代设计和加工，使整个粪便样本的检测过程封闭在卡盒中完成，实现从样本输入到结果输出的C. diff多重一体化检测。最后通过对临床粪便样本的实际检测评估整个体系性能。

艰难梭菌（C. diff）是一种革兰阳性厌氧产毒细菌，是伪膜性结肠炎的主要致病菌，多年来，艰难梭菌感染（C. difficile Infection，CDI）伴随着人类抗生素的滥用变得愈发严重，因此，发展一种简易、快速、准确的CDI检查新方法及新技术，无疑具有重大的临床意义及现实需求，这正是本课题的研究目的。为了满足目前CDI检测快捷性、准确性、经济性方面的需求，本项目采用核酸检测方法，实现对艰难梭菌进行快速高效、安全准确的多重检测，主要有以下内容： .(1).基于磁分离技术的粪便样本的C. diff的核酸提取及自动化流程的设计。(2).基于Realtime-PCR技术的CDI感染毒性判断及菌株分型的多重检测。(3).适用于临床粪便样本的一体化检测卡盒的设计。(4).一体化检测卡盒的优化和临床应用。.项目实施过程中，（1）优化了粪便自动化提取的流程：通过对市面上常用的提取试剂盒的测试和提取流程的优化，摸索并建立了一套提取效率高，花费时间少，性价比高的纯化流程，为后续的在卡盒内一体化自动化检测奠定了基础。（2）设计出高特异性高灵敏度的艰难梭菌菌株毒素基因TcdA、TcdB双重Real-time PCR检测引物和TaqMan探针，最终优化构建出扩增效率高、特异性好的反应体系。（3）设计并3D打印出圆盘形的一体化检测卡盒，也是本项目最大的创新点：通过对整个流程的进一步优化和后续试验需求的分析，设计出一款圆盘形的封闭式检测卡盒，并进行3D打印测试，目前在卡盒中手工流程可实现TcdA、TcdB双重Real-time PCR检测。. 一体化检测技术是最佳的实验流程的优化结果，可以省去繁多的实验步骤，加快检测的进程，同时避免使用过多的仪器以及人工干预，提高了检测结果的准确性，一体化的诊断方案也是目前众多学者和商家的共同目标。本项目中设计的一体化检测卡盒，后面配上我们研究进行中的自动化检测设备进行多重实时荧光PCR检测，可以实现从样本输入到结果输出自动化。本套体系可以广泛地应用在各个领域，如对目前的新冠核酸检测，可以投放到医院，出入境检验检疫站，社区卫生部等需要及时做新冠检测，且对实验人员的专业技能要求不高的场所。另一方面还可以应用于食品安全检测方面，如诺如病毒、非洲猪瘟等的实时检测。.本项目的体系在社会的公共安全，生物安全等方面具有极大的应用前景。