重离子束诱变创制高耐受性嗜热乳杆菌突变体及分子机制解析

Optimization of key physical parameters of heavy ion beams, establishment of technical means to accelerate the breeding process and exploring tolerance mechanism of mutants with high tolerance are the key core of heavy ion mutagenesis technology applied in breeding study of lactobacillus strains. In this project, Salmonella typhimurium NM2009 will be treated by heavy ion beams provided by Heavy Ion Research Facility of Lanzhou. Based on umu-test and flow cytometry methods, the damage strength of Salmonella typhimurium NM2009 induced by heavy ion beams can be accurately quantitative measured, and indirectly reflect the genome damage of lactobacillus thermophilic, as well as the best key physical parameters of heavy ion beams will be optimized；Combined heavy ion mutagenesis technology with Microbial Microdroplet Chemostat, the Lactobacillus thermophilus mutants with high tolerance can be obtained in a short time using high osmotic pressure as a coupling screening target. With the help of Nanopore sequencing technology, the mutation sites in the whole genome between the Lactobacillus thermophilus mutants with high tolerance and original strain can be found, which will well elaborate characterization of genomic variations induced by heavy ion beams; By coupling the key mutation sites with the key genes affecting the metabolic pathway of lactic acid biosynthesis in Lactobacillus thermophilus, the molecular mechanism of Lactobacillus thermophilus mutants with high tolerance will be explored.

优化重离子束的关键物理参数，建立加速育种进程的技术手段以及挖掘出高耐受性突变体的耐受机制，是重离子束诱变技术应用于乳酸菌育种研究的关键。本项目拟利用兰州重离子束研究装置提供的重离子束辐照处理鼠伤寒沙门氏菌NM2009，基于umu-test与流式分选细胞仪方法联用，准确定量表征重离子束对鼠伤寒沙门氏菌NM2009的损伤强度，来反映重离子束对嗜热乳杆菌基因组的损伤，优化出重离子束最佳的关键物理参数组合；联合重离子束诱变技术和微生物微滴恒化器进化技术，以提高耐渗透压力作为筛选耦合靶点，短时间内获得了高耐受性嗜热乳杆菌突变体；利用Nanopore测序技术,在全基因组范围内找到高耐受性突变菌株与原始菌株之间的变异位点，阐述重离子束诱导嗜热乳杆菌基因组突变的变异特征；将可遗传突变位点与影响乳酸生物合成代谢途径的关键基因相耦合，挖掘出嗜热乳杆菌表现出高耐受性的分子机制。

优化重离子束的关键物理参数，建立加速育种进程的技术手段以及挖掘出高耐受性突变体的耐受机制，是重离子束诱变技术应用于乳酸菌育种研究的关键。本项目利用不同重离子束关键物理参数（LET和剂量）辐照处理S. typhimurium NM2009菌株，发现重离子束LET为40 KeV/μ和辐照剂量为20 Gy处理后，SOS诱导系数Fi值最大，为最优物理参数组合；利用最优参数组合的重离子束对原始菌株A69进行诱变，获得的诱变菌液与进化体系联用（含有1M氯化钠），最终从进化11代菌液中筛选得到1株耐渗透压突变菌株（命名为M1）和进化26代菌液中筛选得到9株耐渗透压突变菌株（分别命名为M2，M3，M4，M5，M6，M7，M8，M9和M10），其中6株突变株表现极其显著的乳酸生产能力；基于Nanopore测序技术对原始菌株进行测序和组装，与原始株相比，进化11代菌液筛选得到的菌株（M1）与进化26代筛选得到的其他菌株（M2，M3，M4，M5和M6）具有丰富的SNP和InDel突变位点；随着进化代数增加，筛选得到的耐受性提高菌株的SNP和InDel突变位点也越多；而同为进化26代筛选得到的耐盐菌株之间的SNP和InDel突变位点相差不大；最终将6株突变株的共有突变位点关联耦合分析，获得了2个基因（主要涉及碳水化合物的转运与代谢）的突变，可能是突变株耐受性提高的关键原因。另外，本项目也开展了基于弱化自由基损伤提高乳酸菌以甜高粱汁为原料产乳酸的策略研发以及甜高粱多酚提取利用研究。