碳离子束辐照诱导黑曲霉形态变化影响其柠檬酸积累差异的分子机制研究

As an advanced and efficient physical mutagen, carbon ion beams have been an effective means to excavate functional genes in microbes due to high mutation rate and wide mutation spectrum, for inducing rich phenotype diversity of mutants. This application program aims to take morphological mutant HW2 with high-yield citric acid accumulation and mutant H4 with low-yield citric acid accumulation originated from Aspergillus niger irradiated to 80 Mev/u carbon ion beams accelerated by HIFRL-CSR as research objects. Based on whole-genome resequencing technology, the relevant mutation information involved in cell wall synthesis genes, the composition genes in signaling pathway concerning cell wall integrity and hydrophobin synthesis genes in morphological mutants (mutant HW2 and mutant H4), such as, SNP, InDel, SV and CNV, will be analyzed and identified deeply. Using high-throughput RNA-Seq technique, the different expressions related cell wall synthesis genes, the composition genes in signaling pathway concerning cell wall integrity and hydrophobin synthesis genes between original strain and morphological mutants (mutant HW2 and mutant H4) will be determined at different fermentation phase. On this basis, the molecular mechanism of different citric acid accumulation influenced by morphological alternation in A.niger induced by carbon ion beams irradiations will be well analyzed, which will provide the reference for constructing morphological engineering of A.niger.

碳离子束作为一种先进的、高效的物理诱变源，在辐照育种中表现出突变率高、突变谱广等特点，可以诱导微生物表现出丰富的突变表型，是挖掘微生物功能基因有效的手段之一。本申请项目拟以碳离子束辐照（能量为80 Mev/u）筛选获得的形态显著差异的高产柠檬酸突变菌株HW2和低产柠檬酸突变菌株H4为研究对象；借助基因组重测序技术分析形态突变菌株HW2和H4中涉及细胞壁合成基因、细胞壁完整性信号通路组成基因以及疏水蛋白合成基因的SNP、InDel、SV以及CNV等变异信息；结合高通量转录组学测序技术测定不同发酵周期的原始菌株与HW2菌株、H4菌株中涉及细胞壁合成基因、细胞壁完整性信号通路组成基因以及疏水蛋白合成基因的表达量差异。将上述基因组测序数据和转录组测序数据相关联后，解析出碳离子束辐射诱导黑曲霉菌丝体形态变化影响其柠檬酸积累的分子机制，为今后黑曲霉形态工程菌的构建提供依据。

本项目利用高通量测序技术分析了碳离子束辐照筛选获得的形态差异菌株HW2和H4中涉及细胞壁合成基因、细胞壁完整性信号通路组成基因以及疏水蛋白合成基因的等变异信息，结果显示2株形态突变菌株与原始菌株之间涉及细胞壁生物合成相关基因有多个SNP、Small Indel、SV以及CNV的突变位点。通过转录组学技术研究了2株形态突变菌株和原始菌株在高淀粉水解糖诱导条件下的差异表达基因，结果显示2株形态突变菌株与原始菌株之间涉及细胞壁生物合成相关基因的表达也有差异，其中形态差异极其显著的H4菌株涉及细胞壁合成基因表达差异的基因数最多，且同时在发酵周期为24 h和36 h表现出显著上调或下调的细胞壁合成基因有6个。将基因组测序与转录组测序数据关联后，发现涉及细胞壁合成途径Alpha-1,3-glucan synthesis and processing的相关基因可能对黑曲霉形态发育有着显著影响，可为后续构建黑曲霉形态工程菌的提供关键靶点。. 形态差异的黑曲霉菌株又与其淀粉降解途径关键基因的表达关系密切，淀粉降解途径的关键基因表达上调（如糖化酶基因）能显著促进柠檬酸的积累。在本研究中，以形态差异极其显著的H4菌株为例，对其显著差异代谢途径进行了富集分析，结果显示在发酵周期24 h和36 h中涉及淀粉降解途径表达下调的基因数量最多。基于糖化酶基因表达量以及糖化酶酶活性检测，与原始菌株相比，突变菌株H4糖化酶基因的表达量以及糖化酶酶活性都明显下降；HW2菌株的糖化酶基因表达量和糖化酶酶活性上升。综上所述，重离子束可能是诱导黑曲霉细胞壁生物合成相关基因的突变以及表达，引起其突变体形态差异，影响其淀粉降解途径关键基因表达，进而影响其柠檬酸的合成。