嗜热厌氧杆菌在纤维床生物反应器中乙醇耐受性增强的分子机制研究

Production of Bioethanol from Lignocellulosic Biomass has attracted worldwide attention . Thermophilic anaerobic bacteria have a distinct advantage over mesophiles for ethanol production, especially for their ability to ferment components of cellulosic biomass into chemicals and fuels, but it is still having low ethanol tolerance. This project aim to screen higher ethanol tolerance Thermophilic anaerobic strain using fibrous bed bioreactor for a long time domestication. Differential gene will be found when comparison several ethanol-tolerant mutant with wild type after genome sequencing,and RNA sequencing was used for gene expression level analysis and its regulation mechanism in ethanol tolerance. This research not only generates new breeding method on the basis of fibrous bed bioreactor, but also accelerates industriliazation of ethanol production from cellulosic biomass by using Thermophilic anaerobic bacteria.

从可再生纤维素出发高效转化生产乙醇一直是生物化工研究领域的热点问题。嗜热厌氧菌是生物转化生产乙醇的最理想微生物之一，具有多种优良特性，但依然存在乙醇耐受性较低的缺点。本课题以自主筛选得到的嗜热厌氧杆菌（WT）作为出发菌株，采用纤维床反应器固定化进行长期驯化的新方法，筛选耐受不同乙醇浓度的突变株。在此基础上，采用反向代谢工程技术，通过对典型突变株的基因组测序获得与乙醇耐受性相关的差异基因，然后通过不同培养阶段的样品转录组分析，获得相关基因表达水平及调控机制的基础数据，解析嗜热厌氧杆菌突变株具有高乙醇耐受性的分子机制。这一工作既能产生基于纤维床生物反应器的新育种方法，又能为实现嗜热厌氧菌高效生产乙醇的工业化生产奠定坚实的理论基础和技术源头。

嗜热厌氧杆菌具有木质纤维素降解能力，但其乙醇耐受性较低，限制工业化应用，目前对其全局性乙醇耐受性机制研究较少。本项目主要通过嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium aotearoense的全基因组测序及重测序、转录组测序分析、代谢工程改造，从基因遗传、乙醇刺激的瞬时响应及长时间适应过程三个方面研究嗜热厌氧杆菌乙醇的耐受性机制。经过410代的外源高浓度乙醇胁迫驯化嗜热厌氧杆菌，获得能耐受6%（v/v）乙醇浓度的突变株T.aotearoense ET7。对突变株ET7进行基因组重测序，通过与参考序列T.aotearoense SCUT27进行比对，样品ET7基因组共发现113个单核苷酸多态性（SNP）突变、20个插入或缺失（InDel）突变。其中蛋白质编码区（CDS区）共发现111个突变位点，分布在100个基因上，总的突变率为3.73%，有氨基酸突变的基因总共有83个。转录组测序后，通过对6组实验条件下差异基因的KEGG富集分析发现，差异基因主要显著富集到代谢通路、次级代谢产物合成通路、氨基酸合成通路、核糖体通路、肽聚糖合成通路及蛋白质输出通路等。综合分析高浓度及低浓度条件下，乙醇刺激的瞬时响应及长时间适应出现的76个差异基因，进一步结合每个基因的功能、文献报道发现8个关键基因，对乙醇的耐受性可能有重要的作用，然后对该8个关键基因（过表达adhE、SIG3.2、HP基因以及敲除pbuG、pflA、ABC.PA.A、ABC.PA.P、ABC.PA.S基因）进行代谢工程改造，成功获得了5个突变工程菌株，其中工程菌△ldh/adhE乙醇产量及得率分别提高了18.8%、12.5%；工程菌△ldh/△pflA乙醇得率接近理论得率，具有很好的工业应用前景。以上研究为理性改造工业菌种的产物耐受性提供了思路，同时课题组将其策略应用于产丁醇的梭菌及产乙醇的工业酵母中也获得了积极的效果。