蓝细菌脂肪醛脱羰基酶的结构-功能关系及催化机理研究

蓝细菌脂肪醛脱羰基酶在脂肪烃的生物合成中起着关键作用，研究其结构-功能关系及催化机理，对拓宽类铁蛋白超家族的催化多功能性以及在蓝细菌中构建脂肪烃类生物燃料的高效生物合成途径具有重要的研究意义。.本项目将通过同源建模鉴别集胞藻PCC6803脂肪醛脱羰基酶sll0208的靶点氨基酸，通过定点突变研究靶点氨基酸突变对sll0208活性及谱学（电子自旋共振、荧光、拉曼光谱）等的影响，力图建立蓝细菌脂肪醛脱羰基酶的结构-功能关系，为构建高效合成脂肪烃的基因工程蓝细菌奠定基础；通过电子自旋共振和拉曼光谱研究sll0208催化过程中金属价态的变化、涉及到的自由基及氧分子的活化等,通过氧18同位素标记验证sll0208催化产物甲酸中非醛基氧的来源，提出蓝细菌脂肪醛脱羰基酶遵循的催化机理。

脂肪醛去甲酰加氧酶（aldehyde-deformylating oxygenase, ADO）是蓝细菌脂肪烃合成途径中的一个关键酶。关于ADO同源还原系统、ADO结构-功能关系与催化机理的研究尚未报道。.克隆、表征了三个进化上亲缘关系较远的ADO：1593（细长聚球藻PCC7942）、R1711（点形念珠藻PCC73102）和PMT1231（原绿球藻MIT9313）。选择了1593作为研究目标。.表征了来自PCC7942的铁氧还蛋白Fd (SynPcc7942_1499)与铁氧还蛋白还原酶FNR。比较了化学还原系统与生物还原系统（Fd/FNR/NADPH）（来源于PCC7942或菠菜）对1593酶活的影响，同源还原系统优于其它还原系统，ADO对Fd具有一定的选择性，Fd与FNR之间的电子传递对ADO活性影响很大，同源还原系统的表观kcat比化学的提高了近2.7倍。设计、构建了和还原系统融合在一起的‘自给自足’ADO，还原系统对融合蛋白中ADO的酶活没有太大影响， 3个组分的连接顺序对电子传递及融合ADO的活性有重要影响。表征了来自PCC7942的其它五个Fd，Fd对FNR催化Fd介导细胞色素c还原的动力学研究表明：Fd表现出了不同的动力学特征。研究了不同Fd和FNR偶联对ADO活性的影响，Fd对正庚醛的亲和力有重要影响，Fd-1749与Fd-1499的催化效率远高于其它Fd。.成功得到了1593的5个晶体结构，包括两个野生型（没有结合铁和结合铁的）、两个突变体（Y122F和F86Y/F87Y）及1593和H2O2浸泡后得到的晶体WT-HP。鉴别了参与底物结合通道的靶点氨基酸，研究了氨基酸突变对底物特异性的影响，一些突变体对底物链长的选择性明显提高。鉴别了可能影响ADO活性的靶点氨基酸，部分突变体的kcat提高了100%以上，1593W178R的kcat高达1.81 min-1，比野生型的提高了2.8倍，表现出了最高的催化效率。.基于1593的5个晶体结构可能代表反应循环过程中ADO的不同状态，提出了ADO可能的催化机理。.鉴别的同源还原系统对提高ADO的活性非常重要，构建了自给自足的融合ADO，鉴别了一些对ADO活性及底物链长选择性有重要影响的靶点氨基酸，提出了ADO的催化机理。这对提高ADO的活性及构建高效光合蓝细菌产烃细胞工厂具有重要的指导意义。