原绿球藻MIT9313脂肪醛脱羰酶催化机理的理论研究

The revealing of alkane biosynthase in the cyanobacterial (Science, 2010, 329, 559)triggers the investigation about the catalytic mechanism of alkane decarbonylase for both scientists and industrialists. The exploration of the intermediate structures and the catalytic mechanism of the biosynthesis is theoretically and practically significant for the pathway modification, and the improvement of the enzymatic efficiency. Starting from the crystal structure of cyanobacterium Prochlorococcus marinus MIT9313 aldehyde decarbonylase, we will employ the density functional theory and the ONIOM method to explore the intermediate transformations, search for the rate-limiting step, identify the function of Fe and important amino acids, analyze on the relationship between structure and function, as well as H-bond network and proton transfer. Mutational simulations will be performed to study the effect of protein environment on catalytic process. At last, the enzyme mechanism of alkane formation through aldehyde decarbonylation under anaerobic conditions will be proposed. The carryout of this project helps to understand the aldehyde decarbonylation mechanism of cyanobacterial, and builds the foundation for the targeting mutations to improve the efficiency of alkane biosynthesis.

随着脂肪烃在蓝细菌中生物合成途径的解析（Science, 2010, 329, 559）,脂肪醛脱羰酶的机理研究引起了国内外学术界与工业界的广泛关注。探讨反应各中间体结构及解析相应的催化机理，对提高脂肪醛脱羰酶的催化活性，进而构建高效突变体合成脂肪烃生物液体燃料，具有重要的理论研究意义与实际应用价值。本项目基于原绿球藻MIT9313菌株脂肪醛脱羰酶的晶体结构，采用密度泛函理论和ONIOM分层方法，探讨各中间体之间的相互转化，识别Fe及活性中心各氨基酸在反应过程中的作用，考察体系中的氢键网络和质子转移现象，分析体系结构与功能的关系，确定反应的限速步骤，揭示脂肪醛脱羰实现烷烃转化的反应机理。本项目的研究将有助于理解蓝细菌其它菌株脱羰反应的催化机理，为有针对性的突变以提高烷烃生物合成效率奠定理论基础。

研究背景：.脂肪烷烃更加接近于现有的化石来源柴油，是十分理想的柴油替代物。烷烃在蓝细菌内的生物合成为我们提供了一条解决能源危机和环境问题的途径。研究表明烷烃在蓝细菌内的生物合成过程中，脂肪醛脱羰反应速度慢，限制了烷烃的高效生物合成。..研究内容：.1..确定反应初态.[1]晶体结构中给出的底物是长链羧酸，跟醛作为底物相比有一定的差别。因此首先需要优化底物是羧酸的情况，跟晶体结构进行比较，确定体系中各残基的质子化状态和金属离子的氧化态。.[2]在选定的优化结构中把羧基转变为醛基，优化得到反应的初态。由于两个铁离子都可以与醛耦合，根据配位水和醛之间的耦合模式会有多种可能的初态。.2. 揭示催化反应机理 .[1]考察Fe和配体的作用。不考虑周围氨基酸的影响，选取二铁及配体作为模型体系开展气态下的密度泛函理论研究，从反应物(2Fe+配体+脂肪醛)出发，对每步反应设计各种可能的情况，确定各中间体和过渡态的结构及能量，考察甲酰基与铁之间的耦合，揭示45发生电荷和质子转移的协同性及热力学性质，澄清Fe在反应过程中的氧化态变化，阐明Fe和配体在反应过程中的功能。.[2]揭示蛋白质环境效应。基于前面建立的反应途径，应用ONIOM分层算法处理包含周围氨基酸残基的体系，做进一步优化，考察氨基酸残基对反应过程和中间体结构的影响，确定氨基酸在反应过程中的构效关系，阐明质子转移的反应途径，明确反应的限速步，从分子层次上阐明脂肪醛脱羰反应机理。.[3]研究氨基酸突变效应。根据建立的反应机理，对限速步骤中起关键作用的氨基酸，进行突变模拟，考察突变对中间体结构、反应能垒、限速步骤及其它残基功能的影响。..重要结果：.确定了初始的原绿球藻MIT9313脂肪醛脱羰酶活性中心的结构模型，在此基础上建立了简化模型，分析了反应路径，并考察了外围重要氨基酸残基的重要作用，确定了反映的限速步骤并揭示了反应机理。..研究意义：.本项目以原绿球藻MIT9313脂肪醛脱羰酶为研究对象，以脂肪醛脱羰生成烷烃和甲酸的反应过程为研究内容，了解体系结构-功能的关系，在分子层次上阐述脂肪醛脱羰酶的反应机理。本项目的开展有利于推动对蓝细菌其它菌株催化机理的研究，为实验方面改造得到效率更高的突变体提供重要信息。..在本项目的资助下，已发表SCI学术论文6篇，会议论文1篇。目前仍有部分工作在整理修改中。