核受体PXR调控MRP3基因转录介导结肠癌耐药的分子机制研究

多药耐药相关蛋白3(MRP3)过度表达是肿瘤化疗耐药的重要原因。前期结果显示结肠癌耐药与孕烷X受体(PXR)诱导MRP3过度表达有关，机制有待研究。预试验发现MRP3上游5′端存在PXR反应元件(PXRE)，PXR作为转录因子显著增强MRP3启动子活性。推测PXR调控MRP3基因转录导致药物外向转运增加，是结肠癌耐药重要机制之一。拟构建PXR表达载体、嵌合荧光素酶报告基因和不同长度MRP3上游5′端前导序列表达载体，共转染结肠癌细胞，确定PXRE所在区域；EMSA和染色质免疫沉淀方法分析PXR与PXRE的相互作用；基因定点突变技术构建PXRE突变体质粒，明确PXRE在PXR调控MRP3基因转录中的重要作用；分析PXR调控MRP3转录对结肠癌细胞化疗敏感性的影响，胞内化疗药物含量差异(质谱法)和细胞凋亡相关分子变化。本项目有助于从不同角度揭示结肠癌耐药的分子机制，可能为逆转耐药提供新的策略。

多药耐药相关蛋白3(MRP3)过表达是肿瘤化疗耐药重要原因。前期结果显示结肠癌耐药与孕烷X受体(PXR)诱导 MRP3过表达有关。1、我们组织芯片分析发现PXR和MRP3表达均在癌组织显著高于癌旁组织(P<0.001),且两者表达明显正相关(P=0.0023)，进一步在公共数据库两个独立结肠癌队列中进一步确证了上述结论。2、构建PXR差异表达细胞模型，通过细胞增殖和流式细胞术等实验发现，PXR能够显著阻碍奥沙利铂（L-OHP）抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用；体内裸鼠实验进一步验证了PXR表达能够明显降低L-OHP治疗肿瘤生长的作用。这些体内、外结果表明，PXR表达能够拮抗L-OHP治疗结肠癌的作用。3、PXR作为转录因子，很可能在转录水平上调控下游基因，为了确定PXR影响L-OHP对肿瘤细胞作用的分子机制,我们首先检测了PXR差异表达模型中MRP3 mRNA表达变化，结果发现在PXR高表达细胞中MRP3 mRNA表达也明显升高，蛋白结果进一步证明了该结论。为确定PXR能够结合MRP3启动子区激活该基因转录和表达。我们构建PXR表达和全长MRP3启动子载体与对照质粒共转染细胞，比较荧光素酶表达变化发现PXR能够直接结合MRP3启动子。为进一步定位PXR与MRP3启动子结合的具体区段，我们又构建了MRP3启动子不同区段的报告载体,通过荧光素酶表达变化，最终确定PXR结合MRP3基因5′端-884到-620bp区段，这个结果进一步得到了CHIP实验的证实。结合软件预测结果，PXR最有可能结合MRP3启动子的-875 至-858 区域。这些结果显示，PXR活化后与MRP3基因启动子区直接结合，激活MRP3 转录表达使药物外向转运能力增加，导致结肠癌对铂类药物耐药。4、为了明确PXR和MRP3蛋白表达是否与患者生存存在联系，我们将分析结果分为高低表达组后与患者总生存时间进行关联分析。Kaplan-Meier方法分析发现，PXR和MRP3高表达患者生存期都明显缩短。为排除其他因素干扰，通过Cox-regression多因素分析发现除患者年龄、病理分级和淋巴结阳性数（p=0.000）外，PXR和MRP3蛋白表达均为独立的预后因素（p=0.000）。这些结果表明，PXR和MRP3高表达与患者不良预后相关，且都是独立的预后因素。本项目研究有助于从不同角度揭示结肠癌耐药的分子机制。