多功能木质素降解过氧化物酶的结构与H2O2及碱稳定性关系研究

Lignin biodegradation having advantages of low energy consumption, mild reaction conditions and less contamination has gained great attention in the fields of industry and academia. Versatile peroxidases, which are able to oxidize many types of recalcitrant compounds, belong to a new type of ligninolytic peroxidases. Investigation into the relationship between structure and H2O2,alkaline stability of versatile peroxidases is of great significance for constructing stable ones and exploring their applications in the fields of bioenergy, paper manufacturing and bioremediation. In this project the amino acids and domains which could affect H2O2，alkaline stability of Pleurotus eryngii versatile peroxidase will be identified through crystal structure and sequence analysis, site-directed mutants, chimera proteins and mutant libraries will be constructed by site-directed mutagenesis, domain exchange, saturated mutagenesis, and directed evolution (error-prone PCR, DNA shuffling). The stable H2O2，alkaline mutants, which will be screened via high throughput screening technology, will be overexpressed, purified, and characterized by enzyme kinetics (steady state and pre-steady state) and spectroscopy (including UV-Vis, electron spin resonance, etc.), their H2O2, alkaline stability will be investigated,and the structural factors leading to improved H2O2, alkaline stability will be explained. The relationship between structure and H2O2,alkaline stability of versatile peroxidases will be established, which will lay the foundation for designing and constructing industrial versatile peroxidases.

木质素的生物降解具有能耗低、反应条件温和、污染少等优点，受到学术界、工业界的极大关注。多功能过氧化物酶是一类新型木质素降解过氧化物酶，能氧化多种难以降解的芳香类化合物，研究其结构与H2O2、碱稳定性关系，对于设计、构建稳定的多功能过氧化物酶及探索在生物能源、造纸、生物修复等领域的应用具有重要意义。 本项目将以杏鲍菇多功能过氧化物酶为研究对象，通过理性设计以及定向进化等蛋白质工程技术构建定点突变体、嵌合体、突变体文库，通过高通量技术筛选H2O2、碱稳定突变体，对H2O2、碱稳定突变体进行表达、纯化、动力学和谱学（紫外-可见、电子自旋共振等）表征以及H2O2、碱稳定性研究，阐明导致H2O2、碱稳定性提高的结构因素，建立多功能过氧化物酶的结构与H2O2、碱稳定性关系，为设计、构建适合于工业应用的多功能过氧化物酶奠定基础。

VP（versatile peroxidase，多功能过氧化物酶）是一类新型木质素降解过氧化物酶，能氧化多种难以降解的芳香类化合物，研究其结构与H2O2、碱稳定性关系，对于设计、构建稳定的多功能过氧化物酶及探索在生物能源、造纸、生物修复等领域的应用具有重要意义。. 鉴别了组成VP两个钙离子结合区（稍远和稍近Ca2+结合区）的氨基酸，研究表明：这些氨基酸突变对酶活、Ca2+含量、pH及热稳定性有一定影响，对蛋白质的二级结构没有明显影响，Ca2+含量与酶活关系密切，首次构建了只结合稍近Ca2+的木质素降解过氧化物酶，并且首次发现木质素降解过氧化物酶的热稳定性和稍近Ca2+也有关。. 经过对VP及LiP、MnP及CiP等过氧化物酶的晶体结构及序列比对分析，鉴别了可能影响VP H2O2稳定性的氨基酸，结果表明易被氧化的蛋氨酸、血红素附近、组成H2O2结合区以及远程电子转移路线附近的氨基酸对H2O2稳定性有一定的影响，双突变及多突变体表现出一定的累加效应，部分突变体的催化效率和H2O2稳定性都提高。H2O2稳定性的提高可能是由于突变延迟或抑制了化合物III的生成和/或突变导致血红素漂白引起的。. 基于VP和CiP及PNP等碱性稳定过氧化物酶的晶体结构及序列比对分析，鉴定了有助于提高VP碱及热稳定性的靶点氨基酸及结构因素等，设计、构建了一系列嵌合体突变体，研究发现：在VP稍远Ca2+附近的环上延长CiP的6个氨基酸提高了VP的pH和热稳定性，在VP稍远Ca2+附近的环上引入一个二硫键也提高了VP的pH和热稳定性。. 对有助于提高VP H2O2稳定性的氨基酸分别进行饱和突变，构建了饱和突变体文库。建立了筛选耐高浓度H2O2突变体的方法，针对每一个位点都筛选到H2O2稳定性大大提高的突变体，并且构建了包含所有突变的稳定突变体。. 通过两步易错PCR（正常易错PCR和逐步稀释易错PCR）的方法，构建了随机突变文库，建立了碱稳定突变体的筛选方法，筛选到碱和H2O2稳定性都大大提高的突变体。研究表明，不同位置的氨基酸对VP的碱和H2O2稳定性有不同的影响。. 本项目的研究结果为设计、构建适合于工业应用的多功能过氧化物酶奠定基础。