ROS反馈环在哺乳期PBDEs暴露致大鼠神经发育毒性的机制研究

PBDEs具有神经发育毒性，但其机制不清楚。婴幼儿时期为神经系统发育的关键期，乳汁为重要的暴露来源。PBDEs使神经细胞发生氧化应激产生的ROS使细胞内Ca2+浓度增加，激活calpain形成cdk5/p25复合物，后者使重要的抗氧化蛋白酶Prx磷酸化，Prx清除ROS的能力降低，导致细胞内ROS含量增加；我们推测在PBDEs神经发育毒性中存在ROS-cdk5/p25-Prx磷酸化-ROS反馈环，使细胞内ROS大量增加，最终引发神经细胞死亡。本研究以神经细胞氧化损伤为出发点，运用动物行为学、细胞培养、流式细胞术、免疫组化、酶活性检测、基因定量检测、蛋白印迹和RNAi等技术探讨哺乳期PBDEs暴露对大鼠神经发育毒性的可能机制，为预防和控制PBDEs对神经系统的危害提供科学依据。

本项目通过体内和体外实验，研究哺乳期BDE-153暴露对大鼠的神经发育毒性和主要机制。本研究分两部分进行：第一部分主要研究了BDE-153的神经发育毒性。首先动物实验发现，哺乳期一次暴露BDE-153能引起大鼠青少年期和成年期学习记忆能力下降，自发行为活动功能紊乱和海马神经细胞的损伤和凋亡，这种损伤是不可逆的。体外实验也发现BDE-153染毒能引起培养的神经细胞凋亡和细胞膜通透性增加，证明了BDE-153具有神经发育毒性，可能与诱导神经细胞的凋亡有关。第二部分分别从氧化损伤与抗氧化损伤方面和Ca2+-calpain-cdk5/p25信号途径在BDE-153神经发育毒性中的主要作用，并采用多种化学干预剂干预某些关键性信号分子后检测相应指标的改变。结果显示，BDE-153在体内和体外研究中均能引起细胞的氧化损伤，使细胞内SOD、GSH以及PrxⅠ和PrxⅡ的水平下降，MDA、ROS、RNS（NO和nNOS1）的水平大大增加；细胞内Ca2+浓度增加，启动了Ca2+-calpain-cdk5/p25信号途径。分别采用PD150606干预calpain、NAC干预ROS以及Roscovitine干预cdk5之后，比较干预前后以上各种指标的变化情况，基本明确BDE-153作用于神经细胞后，首先发生了氧化损伤，产生的大量的氧化应激产物ROS和NO，然后启动了Ca2+-calpain-cdk5/p25-PrxⅠ和PrxⅡ信号途径，进一步加剧了细胞的氧化损伤，形成了ROS和NO的反馈环并引起了神经细胞的凋亡。即证实了课题的科学假说：PBDEs主要通过ROS-Ca2+-calpain-cdk5/p25-Prx-ROS途径，形成ROS、RNS-Ca2+-calpain-cdk5/p25-Prx-ROS、RNS恶性反馈环，损伤神经细胞引起神经发育毒性。. 此外，还增加了两部分的研究内容：1）通过对神经细胞线粒体和内质网结构和功能的研究，发现内质网可能是BDE-153神经毒性的主要的靶细胞器；2）检测了与学习记忆和神经系统发育密切相关的AchE、ChaT以及多种神经营养因子的变化，指出体内外AchE、ChaT酶活力的下降和神经营养因子的水平降低也是BDE-153神经发育毒性的主要机制。