Reticulon家族蛋白在甜菜黑色焦枯病毒复制中的作用机理

Positive-stranded RNA virus always remodels the endomembrane system to form the virus replication factories. Our previous work indicated that Beet black scorch virus (BBSV), a member in the genus Betanecrovirus of family Tombusviridae, induces the membrane curvature of the endoplasmic reticulum (ER) to form the viral replication vesicles. However, the host factors that involved in the rearrangement of ER during BBSV infection remains largely unknown. Recently, our preliminary data suggested that the ER-localized reticulon family proteins (RTNs) are required for BBSV infection. Based upon this, the proposal here aims to investigate the functional roles of RTNs in BBSV replication and determine how the RTNs participate in the BBSV replication. The effect of functional disruption of RTNs on the ER membrane remodeling and the build-up of membranous replication vesicles will be particularly studied. This project also aims to establish the functional link between BBSV replication, RTNs, ER stress and ER-phagy, thus presenting a mechanistic model of the functional roles of RTNs in BBSV replication at last. Our studies would provide new evidence for further understanding the molecular mechanisms underlying the BBSV-host interaction, and also provide a reference for studying other viruses that replicate on ER-derived membranes.

正义RNA病毒侵染宿主细胞后往往重塑细胞内膜系统形成病毒复制的场所。申请人前期研究工作证实甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus，BBSV)可诱导内质网(ER)膜结构发生改变进而形成复制小泡，但是对于何种宿主因子参与BBSV诱导ER膜结构的弯曲在很大程度上未知，最近我们的研究结果表明，定位于ER的reticulon（RTN）家族蛋白是BBSV侵染所必需，基于此，本申请课题拟深入研究RTNs蛋白在BBSV复制中的作用机理，明确RTNs蛋白如何参与BBSV的复制，重点分析RTNs蛋白功能的异常对BBSV诱导ER膜弯曲和形成复制小泡的影响，尝试建立BBSV复制、RTNs蛋白、内质网胁迫和ER自噬之间的关联，最终建立RTNs蛋白参与BBSV侵染的机制模型，为深入理解BBSV复制过程中与宿主互作的分子和细胞机理提供新的科学证据，也为研究其他在ER膜上进行复制的病毒提供参考。

正义链RNA病毒进入宿主细胞后一个关键的步骤是诱导细胞内膜形变形成病毒的复制场所，前期我们解析了甜菜黑色焦枯病毒（Beet black scorch virus, BBSV）在内质网上复制场所的三维机构，并且证明BBSV复制酶辅助蛋白p23在此过程中发挥关键作用，但是对于何种宿主因子参与BBSV诱发的内质网膜形变在很大程度上仍然未知。本项目以维持内质网管状结构的Reticulon家族蛋白为切入点，深入分析了其在BBSV重塑内质网膜形成复制场所过程中所发挥的功能。项目研究取得了以下主要研究结果，数据库序列挖掘和分析表明本生烟中存在14个RTNLB蛋白同源物 (paralogs)，且每个RTN蛋白又包含数量不等的同源异构体（isoforms）；通过双分子荧光互补，病毒诱导的基因沉默和过表达手段筛选到RTNLB2蛋白在BBSV侵染中发挥重要作用。进一步确认了RTNLB2与BBSV p23蛋白互作，通过遗传学、细胞生物学和生物化学等手段证实RTNLB2在BBSV复制中发挥正调控作用；明确了RTNLB2的双亲螺旋（amphipathic helix, APH）结构域的突变不影响其与BBSV p23的互作，但是严重影响了BBSV复制场所的形态建成；还证实了RTNLB2在BBSV复制时与p23互作被招募至病毒复制场所来帮助病毒复制复合体的组装；除了BBSV, RTNLB2还参与其他在ER上复制的正义链RNA病毒的侵染；初步建立了RTNLB2，ER自噬与BBSV侵染三者之间的关联。以上研究结果为深入理解正义链RNA病毒复制的分子机理提供了新的科学数据。