甜菜黑色焦枯病毒复制酶小亚基p23的亚细胞定位及其致病机制分析

The replication of positive single strand RNA plant viruses depends on specific endomembrane, and the auxiliary replicase protein play a pivotal role in the morphological alterations of endomembranes and the formation of viral replication factory. Based upon previous studies, in this proposal, (1) we will use the methods of cell biology to analyze the subcellular localization of the p23 auxiliary replicase protein of Beet black scorch virus, the critical domain that determine the membrane localization of p23 will also be mapped. (2) Meanwhile, the pathological morphology alteration of the endomembrane during the expression of p23 as well as the subcellular localization of BBSV genomic RNA will also be investigated, and then to ascertain the site for the assembly of virus replication complex (VRC). (3) Previous BiFC assay showed that p23 could interact with Hsp70 and Hsp90 in vivo, respectively. Next, further experiments will be conducted to confirm this result, and the roles of Hsp70 and Hsp90 involved in the infection of BBSV will be systemically studied. (4) Overexpression of p23 could induce cell death in the inoculated leaves and preliminary results indicated that this phenomenon was probably related with the activation of unfolded protein response (UPR). We will further study the roles of UPR involved in the pathogenicity of the p23 as well as in BBSV infection, and finally a model for the replication of Necrovirus will be proposed. Our results will broaden the current understanding of the replication model for the virus in the Tombusviridae.

单链正义RNA病毒的复制往往发生在细胞内特殊的膜结构上，而病毒复制酶小亚基在介导膜结构的改变以及复制"工厂"的形成中发挥着关键作用。在前期工作的基础上，本项目拟：(1) 利用细胞生物学等手段明确甜菜黑色焦枯病毒（BBSV）复制酶小亚基p23的亚细胞定位，确定其关键跨膜区；(2) 通过观察BBSV基因组RNA的定位以及p23所致细胞内膜结构的改变，明确BBSV在细胞内复制的场所；(3) 分析p23与寄主Hsp70和Hsp90的相互作用在BBSV侵染过程中的作用；(4) 分析p23超表达导致叶片坏死的机制，重点研究蛋白错误折叠反应（UPR）在p23的致病以及BBSV复制增殖过程中的作用。通过以上工作明确BBSV复制酶小亚基p23的亚细胞定位及其在病毒致病过程中的作用机制，提出坏死病毒属（Necrovirus）病毒的复制模型，丰富人们对番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）的认识。

单链正义RNA病毒的复制往往依赖各种细胞内膜系统上，而病毒复制酶小亚基在介导膜结构的改变以及复制“工厂”的形成中发挥着关键作用。本项目研究了甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus, BBSV)复制酶小亚基p23的亚细胞定位及其决定其膜定位的关键区段，确定了BBSV复制的场所，分析了p23与Hsp70和Hsp90发生互作的分子机制及这种互作对BBSV侵染的作用。研究了未折叠蛋白反应(UPR)如何影响p23的致病性进而调节BBSV复制增殖。.主要研究结果如下：.1. 解析了BBSV复制场所的三维结构，明确了诱导BBSV复制场所形成的关键病毒组分。BBSV侵染本生烟后诱导内质网（ER）发生聚集和凹陷，形成典型的泡包结构，免疫电镜分析表明该泡包结构是BBSV复制发生的位点，且p23是诱导BBSV复制场所形成的关键因子。利用先进的三维重构技术，解析了BBSV的复制场所的三维结构.三维结构表明，BBSV的侵染导致本生烟细胞中形成大量的ER衍生的小泡状结构，泡包结构间存在管状联通，并且每个小泡通过小口与外界进行联通、实现物质的交换。这也是第一例植物病毒侵染寄主细胞后复制场所的三维结构，为深入理解正义RNA病毒复制复合体的结构和微环境提供了重要的科学数据。.2. 项目负责人应邀为Frontiers in Plant Science撰写植物病毒复制场所三维结构和形成机制的综述。系统总结和对比了近年来植物病毒复制场所三维结构的形态特征和差异，并对诱导病毒复制场所形成的关键病毒和宿主因子进行了小结。.3. 揭示了Hsp70家族蛋白Hsc70-2在BBSV复制中的新功能，证实了Hsc70-2 可以分别与BBSV p23和CP发生互作，并在介导CP对于BBSV复制的负调控中发挥重要作用。.4. 明确了未折叠蛋白反应(UPR)在BBSV侵染中发挥重要作用。超表达p23蛋白时，可诱导本生烟注射叶片的坏死且UPR途径的基因被普遍上调，而超表达UPR途径NbBLP-4蛋白抑制BBSV p23诱导的坏死。沉默UPR途径关键基因bZIP60时可降低BBSV在本生烟中的积累水平，说明BBSV在ER上建立复制场所的过程中，UPR反应发挥了某种功能.5. 证明了BBSV CP存在磷酸化修饰，这种翻译后修饰对于CP形成稳定的病毒粒子，以实现病毒的长距离运动发挥了重要作用。