犬瘟热病毒血凝蛋白与SLAM受体在感染中的分子机制研究

The Hemagglutinin(H) potein of Canine Distemper Virus(CDV) plays an improtant role in the infection when the receptor is SLAM moleculer which abounds in animal body, so the reseach on H protein and SLAM receptor gives a great meaning to illutrate the mechanism of virus infection and action. We utilize virus rescue system to obtain CDV with mutation in H gene, somewhere closely related to SLAM receptor, then to infect SLAM receptor cell, then to use CDVmonoclonal antibody and second antibody to combine virus, meanwhile using antibody to combine SLAM receptor, compared and analysed with normal virus infection to study the function of H protein Recognition and combined with SLAM receptor; A H protein and F protein temporal expression vector was constructed and coreansfected in Vero cell which lead to syncytium to inspect weather some specific postion on H protein has effect on trigger Fusion protein; to prepare SLAM protein monoclonal antibody, to find distribution and mutation of SLAM by immunohistochemical method on both healthy and different stages of infection.We get a conclusion of CDV SLAM receptors and viral protein interaction mechanism, a mechanism of internal protein molecules, the relationship between infection and SLAM receptor an effect of receptor expression in infection. It is significant to understand the molecular mechanism of protein CDV infection and the research of methods of attenuated virus in this study.

犬瘟热病毒血凝蛋白（H）通过利用SLAM受体在病毒感染中发挥重要作用，而SLAM分子在动物体内分布广泛且数量众多，研究H蛋白和SLAM受体相互作用机理对阐明病毒感染机制有重要意义。本项目拟通过反向遗传机制构建SLAM相关位点突变毒株，接种SLAM受体细胞，利用CDV单抗和SLAM单抗对接毒的细胞上吸附病毒粒子和SLAM受体进行定位并与正常病毒做比较，以研究H蛋白在SLAM受体识别和结合中的作用；利用H蛋白和F蛋白在Vero细胞中一过性表达，观察多核体形成情况，以研究和分析H蛋白特定区域对于启动F蛋白的影响；制备SLAM受体蛋白抗体，免疫组化方法研究犬瘟热感染前后SLAM受体变化和分布。通过此研究探寻犬瘟热病毒SLAM受体和病毒蛋白间作用机制，犬瘟热病毒内部蛋白分子间作用机理，病毒感染与SLAM受体关系，感染对受体表达影响。本研究有助于进一步阐明CDV蛋白在病毒感染中的分子机制，也为病毒致病机理研究提供了方法。

CDV H与其主要受体SLAM相互作用参与病毒感染及致病过程，本项目主要开展SLAM在体内和体外与CDV相互作用研究，在本项目资助下，发表研究论文5篇，培养硕士研究生5名，获得山东省高等学校科学技术奖二等奖1项，授权发明专利1项，实用新型专利1项，正在申请的发明专利2项，完成了项目申请书的研究内容和考核指标，相关研究成果如下: 1）CDV急性感染水貂在感染前后及感染后不同时期SLAM受体变化和分布及其与CDV相关性。结果表明，攻毒后7-21天肺脏（支气管上皮细胞以及淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞）、脾脏（淋巴细胞和单核细胞）和外周血淋巴细胞中均检测到大量CDV抗原，这与临床上CDV感染的泛嗜性与免疫抑制一致。SLAM抗原主要分布于淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞，在病毒感染7d有一个表达上升的过程，14d达到顶峰，21d又下降到感染前的水平，说明CDV感染早期激活免疫细胞，使SLAM表达上调，后期由于机体抵抗力下降，淋巴细胞减少，使SLAM表达又下调。2）CDV H上的SLAM表位在病毒受体识别、结合和F蛋白启动中作用。突变毒株UnSLAM-CDV可以在稳定表达nectin4细胞上生长，不能在SLAM受体细胞上生长，表明H蛋白上的526-9、547/8位点在SLAM受体识别和结合中发挥作用；获得了6个点突变H重组质粒，与F蛋白共转染观察合胞体形成情况，结果表明H蛋白526、529位氨基酸对于H/SLAM启动F蛋白膜融合有显著影响（P＜0.05）。3）CDV M对H/SLAM/F膜融合及CDV复制的影响，及M缺失CDV的构建。结果表明，M基因表达下调时，H/F/SLAM引起的合胞体变小甚至消失，病毒RNA及N蛋白表达都受到抑制（P＜0.01），说明M是CDV复制的必需蛋白；当M基因过表达时，病毒合胞体也明显变小，病毒RNA差异不显著（P＞0.05），病毒N蛋白表达有所降低，说明M基因过表达会通过影响H/F/SLAM膜融合下调病毒的复制。成功构建了M基因缺失CDV cDNA克隆，拯救获得CDV复制缺陷株，该株在非复制许可细胞及鸡胚内均不能复制，在小鼠体内能够诱导中和抗体。本研究有助于进一步阐明SLAM在病毒感染中的分子机制，也为CDV基因工程疫苗研究奠定了基础。