荞麦种子发育过程中FtNAC1转录因子的功能分析及调控机制研究

Buckwheat (Fagopyrum) is an important crop valuable for not only food but also medicine. Its seeds are rich in various nutrients, such as protein, starch, fatty acid, dietary fiber, vitamin, and flavonoid. Plant specific NAC transcript factor is involved in the process of seed filling. We identified a gene that was highly expressed in the filling seeds from the transcriptome during buckwheat seed development. As it contains a plant specific NAM domain, we named it FtNAC1. The deduced protein is most closed to the rice ONAC023 protein in phylogeny. The promoter region of FtNAC1 includes many cis-acting elements that respond to hormones and stresses, such as CGTCA-motif, SARE, TCA-element, ABRE, EIRE, HSE, MBS, TC-rich repeats, and W box, as well as four cis-acting elements that required for endosperm expression. These indicate FtNAC1 might be involved in the stresses response and endosperm development. In this study, we plan to clone the FtNAC1, clarify its tissue specific expression, and its expression pattern during seeds development. In addition, we try to identify its function by plant transgenic technology. This study will not only identify the function of FtNAC1 in seed filling, but also provide potential valuable gene resources for improving the buckwheat seed quality and protein content.

荞麦是一种公认的药食兼用粮种，其种子中富含丰富的营养物质，如蛋白、淀粉、脂肪、膳食纤维、维生素、黄酮类等。植物NAC转录因子参与种子灌浆过程的调控。前期从荞麦种子发育的转录组中筛选了一个表达丰度高、并且表达量随种子发育过程逐渐升高的NAC家族基因(FtNAC1),与水稻ONAC023的亲缘关系最近。FtNAC1启动子区域中含有许多响应激素和逆境,以及胚乳优势表达的顺式作用元件，推测FtNAC1可能影响荞麦的抗逆性，并且与胚乳发育有关。本研究计划克隆FtNAC1基因，分析其组织特异性和在种子灌浆过程中的表达趋势，鉴定启动子区域中的顺式作用元件，通过植物转基因技术鉴定FtNAC1基因的功能。本研究不仅明确了FtNAC1基因在荞麦种子灌浆过程中的作用，也为改善荞麦种子品质和蛋白含量提供潜在的优异基因资源。

荞麦是一种公认的药食兼用粮种，其种子中富含丰富的营养物质，如蛋白、淀粉、膳食纤维、维生素、黄酮类等。在小麦、水稻等大宗作物中，NAC转录因子参与种子发育和非生物胁迫多有报道。然而在杂粮作物荞麦中，却仅有少量报道。本项目基于发表的品苦1号苦荞基因组，在全基因组水平上鉴定了72个NAC转录因子家族基因，均具有NAC转录因子家族特有的NAM结构域。基因结构分析表明,除FtPinG0002967400.01.T01基因外,苦荞NAC家族其余71个基因均含有内含子72个NAC基因共有7个保守基序，在苦荞8条染色体上均有分布。系统进化分析表明,苦荞NAC蛋白序列与拟南芥的可以分为9个亚家族。表达分析表明，72个NAC转录因子具有组织特异性，且其中有33个在苦荞发育种子中表达。经初步筛选，选取了9个NAC基因对其进行了基因克隆，并提交到Genbank，这9个基因分别为FtNAC11（MW355481）、FtNAC12（MW355482）、FtNAC17（MT641452）、FtNAC15（MN136229）、FtNAC26（MW355483）、FtNAC28（MW355484）、FtNAC65（MW355485）、FtNAC70（MW355486）和FtNAC78（MW355487）。通过qRT-PCR分析其中7个基因的表达模式，发现他们存在组织特异性，其中FtNAC70只在种子中表达。且这7个基因均可以响应非生物胁迫（干旱、高盐和冷）和激素应答（MeJA、ABA和GA），其中FtNAC70的响应程度最高。随后，对FtNAC11、FtNAC28和FtNAC70三个基因进行深入分析发现FtNAC11和FtNAC28蛋白均定位于细胞核中，且具有转录激活活性，构建了植物表达载体进行拟南芥遗传转化，并获得了转基因后代株系。此外，将FtNAC11启动子在拟南芥中过表达，结果表明FtNAC11在幼苗的茎和老叶中有表达，在成熟的果荚和种子中有表达。最后对FtNAC70在拟南芥中进行了遗传转化，结果表明FtNAC70可以减缓高盐胁迫和干旱胁迫对拟南芥生长的抑制。本研究不仅为苦荞NAC转录因子家族研究提供了基因资源，也初步明确了3个苦荞NAC基因的功能，为后续研究提供了一定的参考。