同源重组修复蛋白RecF与ATP、DNA以及RecR多元复合物的结构生物学研究

RecF pathway proteins play an important role in the restart of stalled replication and DNA repair in prokaryotes. The RecF, RecO and RecR proteins belong to a group of recombination mediators (RMs) proteins that includes eukaryotic proteins such as Rad52 and BRCA2, RMs load RecA protein onto ssDNA-binding protein (SSB)-coated ssDNA and then help RecA to form a nucleoprotein filament. RecF cycles through a complex pathway that involves ATP-dependent dimerization, DNA binding, and repeated interactions with RecR in a DNA-substrate-dependent manner. RecF belongs to ABC-type ATPases, which function through an ATP-dependent dimerization, and the dimer is the functional and structural unit in RecFOR pathway. No dimer structure of RecF has been reported. We have solved the crystal structure of RecF from Thermoanaerobacter tengcongensis. RecF exhibits a high degree of structural similarity with the head domain of Rad50, but lacks its long coiled-coil region. Moreover, RecF exhibits dimerization dependent ATP and has ATPase activity. This project intends to study the crystal structures of RecF-ATP dimer, RecF-DNA complex and RecF-ATP-DNA-RecR four components complex and to study the interaction condition of RecF interaction with DNA or RecR using experimental methods of SPR, ITC, EMSA and AFM. At last, based on the three-dimensional structure and functional research, clarify the molecular mechanism of RecF ATPase activity, the mechanism of RecF, DNA and protein interactions, and further clarify the molecular mechanism of RecFOR pathway.

RecF、RecO和RecR是参与RecFOR路径主要的重组调节因子，其作用是促进RecA的装载，形成RecA蛋白纤丝。RecF在RecFOR路径中的主要作用是携带RecR识别DNA损伤位点，提供ATP能量。RecF二体形式是其在RecFOR路径中发挥功能的基础，然而目前对此没有结构生物学的研究。我们在解析了来源于腾冲嗜热菌RecF单体晶体三维结构的基础上，发现RecF依赖ATP形成二体，并且具有ATP酶活性。本课题拟研究RecF-ATP二体晶体结构、RecF与DNA的晶体结构以及RecF与DNA及RecR多元复合物的晶体结构，运用SPR、ITC、EMSA和AFM等实验方法研究RecF与DNA ,蛋白质及ATP的相互作用方式和作用条件。在三维结构与功能研究的基础上，阐明RecF ATP酶活性的分子机理，RecF与DNA及蛋白相互作用的机理，为研究RecFOR路径的作用机制奠定基础

DNA损伤的修复对所有生命体维持染色体的完整都非常重要。RecF蛋白是RecFOR修复系统的核心蛋白，在DNA重组修复，基因的遗传重组和DNA复制中发挥作用。RecF在体内复制和重组之间会存在转换，当RecF遇到RecO和RecR以后会从复制过程中转移到损伤的ssDNA上进行重组DNA修复。RecF蛋白结合DNA的特性在体外实验中已有报道，RecF蛋白结合ssDNA不依赖ATP，而结合dsDNA依赖ATP。RecF蛋白的活性试验表明其参与了重组修复从起始到终止的整个过程。目前只有一篇RecF单体结构的文章，发表在2007年的EMBO杂志上。RecF是ABC式的ATP，具有依赖于ATP二体化的性质。但是到目前为止并没有关于RecF蛋白二体的晶体结构的报道。我们的研究以RecF单体结构、RecF-ATP二体结构为基础，研究RecF-DNA，RecF-ATP-DNA以及RecF-ATP-DNA-RecR蛋白复合物的结构与功能。我们得到了TTERecF单体的晶体结构（PDB：5Z67），RecF-ATP二体的晶体结构（PDB：5Z68），RecF-ATPɤS的晶体结构（PDB：5Z69），对比了三个晶体结构发现Walker A motif是RecF结合ATP，以及结合了ATP以后形成二体的核心区域。结合了RecF和DNA相互作用的BLI实验，RecF和ATP、ATPɤS相互作用的ITC实验，以及超速离心和分子筛实验检查RecF蛋白在溶液中的状态。确定了RecF蛋白依赖ATP形成二体的方式，及RecF-ATP的二体结构。并确定了RecF蛋白依赖ATP形成二体是RecF与dsDNA相互作用的关键。这一部分工作发表在Scientific Reports上。此外在RecF-ATP二体结构的基础上，我们研究了RecF-ATP-DNA三元复合物，并且得到了3.2Å分辨率的晶体，目前这部分工作正在进行中。在RecF-ATP-DNA复合物的基础上研究RecF与RecR蛋白和RecOR蛋白复合物相互作用的机制。本项研究揭示了RecF的ATP酶分子机制，为研究RecFOR路径的作用机理奠定了基础。