TXNIP介导早期糖尿病视网膜病变RGC细胞自噬和凋亡的调控机制

The balance between cellular autophagy and apoptosis is an important mechanism to maintain homeostasis. Recently, thioredoxininteracting protein (TXNIP) has been shown to be an upstream checkpoint to modulate the balance between cellular autophagy and apoptosis through a series of signal pathways. Literatures and our previous work showed that TXNIP is significantly upregulated upon high glucose induced stresses, and maintained over the whole process of diabetic retinopathy (DR). But the detailed mechanism remains unknown. In this project, we plans to use high glucose challenged rat retina and primarily cultured retinal ganglion cells (RGCs) to evaluate the expression of TXNIP, and autophagy- and apoptosis-related markers in different stages of applied stress. At the mean while, we will use blocking antibody, RNA interference, or inhibitor TGS to down regulate TXNIP, in order to select the optimal protective effects on RGC. This study might provide new strategy for neural protection in early DR.

细胞自噬和凋亡之间的平衡状态是机体自我保护的重要机制，硫氧还蛋白内源性抑制蛋白（TXNIP）可通过多种途径调控细胞自噬和凋亡。文献报道和我们的前期研究证实：TXNIP在RGC受到高糖应激损伤的早期即迅速升高并在糖尿病视网膜病变（DR）过程中持续高表达，且伴随神经节细胞（RGC）凋亡和自噬，但是TXNIP在早期DR中的具体调控机制尚未明确。本项目拟首先在糖尿病大鼠模型和体外高糖/低氧损伤的RGC中分别检测TXNIP、自噬和凋亡信号分子的时空表达，并与相应的视网膜应激水平相对应；然后在早期DR不同病理损伤阶段，通过阻断性抗体、RNA干扰或TXNIP抑制剂TGS等多种手段下调TXNIP，观察其对于RGC自噬和凋亡的调控机制，最终筛选出适合早期糖尿病应激损伤的RGC保护性调控策略。通过本研究，有望为DR的早期视神经保护提供实验依据和理论基础。

本课题由若干小课题构成。动物实验建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型；积极检测动物模型相关因子指标，并且对实验技术进行了优化；通过光学相干断层扫描检测视网膜结构变化，初步分析糖尿病对视网膜结构的影响；原代培养大鼠视网膜神经节细胞并行免疫荧光（Brn3a）鉴定；持续培养原代的Müller细胞并且对其在高糖刺激下的各项指标进行检测；免疫荧光检测TXNIP在糖尿病组及正常组视网膜内的表达及定位；观察糖尿病对视网膜功能的影响：视网膜电图（ERG）；检测自噬相关指标（beclin1，Atg12-Atg5，p62，LC3I/II）；玻璃体腔内注射腺相关病毒介导的小干扰RNA（si-TXNIP）,观察组间TXNIP及LC3的表达；大鼠视网膜组织石蜡切片HE染色观察组间的神经节细胞层厚度及神经节细胞数；大鼠视网膜组织石蜡切片免疫组化观察组间TXNIP的表达量；western blot鉴定组间TXNIP及LC3表达量；荧光定量PCR检测组间TXNIP mRNA表达量；蛋白数据库SRTING预测与TXNIP相互作用的蛋白；使用不同浓度糖处理muller细胞系（rmc-1），通过western blot观察自噬指标的变化；使用巴弗洛霉素A1处理正常组及高糖组，使用western blot观察自噬流指标的变化；过表达TXNIP观察TXNIP的表达及自噬指标的变化；下调TXNIP观察TXNIP的表达及自噬指标变化；通过CCK8实验测定组间细胞活力；通过western blot观察组间凋亡指标的变化；使用自噬抑制剂3-MA处理细胞，观察自噬及凋亡指标的变化；使用PI3K通路抑制剂观察组间自噬指标变化。结论：在糖尿病（高糖）状态下TXNIP表达水平升高，PI3K-AKT-mTOR通路被抑制，细胞自噬流增强，细胞凋亡增多，视网膜厚度变薄，视网膜神经节细胞减少，视网膜电图出现ab波幅下降；下调TXNIP可以抑制细胞自噬及凋亡，激活PI3K-AKT-mTOR通路。在糖尿病中，TXNIP通过PI3K-AKT-mTOR通路调控视网膜细胞自噬及凋亡。