神经胶质细胞GFAP启动子调控内源性BDNF表达对小鼠糖尿病视网膜神经节细胞的保护作用

前期研究中，我们发现了脑源性神经营养因子（BDNF）对糖尿病早期视网膜节细胞（RGCs）凋亡的保护机制，同时也发现了两个问题。第一，作为RGCs损伤的最重要保护因子，BDNF主要来源于哪里？什么方法才是BDNF治疗RGCs凋亡的最佳途径？目前还没有这方面的报道。为了解决这两方面的问题，我们建立两种（gfap－/-和pGFAP-BDNF/c-myc）动物模型，通过体内和体外研究，采用视网膜铺片、免疫组化、RT-qPCR、ELISA分析以及Western blot等分子生物学技术，利用流式细胞仪、电子显微镜和共聚焦荧光显微镜动态观察，拟探讨（1）内源性BDNF的主要分泌机制；（2）通过基因调控内源性BDNF的表达，寻找一种长期、稳定和有效的治疗方法，为以RGCs凋亡为基本病理机制的致盲性眼病（糖尿病视网膜病变、青光眼、外伤和视神经病变等）提供一条新的治疗途径。

本课题由若干小课题构成。动物实验建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，氧诱导视网膜病变小鼠模型，NaIO3静脉注射制作视网膜变性小鼠模型，分别行玻璃体腔注射GSK-3抑制剂氯化锂，TUNEL染色观察RGCs凋亡，WB检测GSK-3激酶磷酸化水平；玻璃体腔注射SHH激动剂和抑制剂，视网膜铺片观察RGCs存活率，WB检测SHH, SMO, GLI1,GFAP, ERK1/2, PI3K, 和 P38表达水平；玻璃体腔注射金诺芬，视网膜铺片观察血管无灌注区，WB检测视网膜VEGFR2，VEGFR3，AIP1，HIF1α ,VEGF的表达；玻璃体腔注射mini-αA，HE染色观察视网膜厚度，TUNEL染色检测凋亡。细胞实验构建血清剥夺模型，高糖培养原代Müller细胞，金诺芬处理淋巴内皮细胞系（SVEC），NaIO3处理ARPE-19细胞系，分别行氯化锂处理细胞，MTT、流式检测细胞活性和凋亡；WB检测AKT的Thr308、Ser473和GSK-3α/β的p-Ser21/9以及cleave caspase-3含量；SHH激动剂和抑制剂cyclopamine处理Müller细胞，WB和RT-PCR检测SHH, SMO, GLI1 and GFAP含量；金诺芬处理SVEC，MTT，Hoechst和流式检测细胞凋亡，WB检测TrxR2, Trx2, NF-κB, phosphor- and total p38MAPK, and VEGFR3含量；qRT-PCR和WB检测VEGFR3,LYVE-1,磷酸化和总的p38MAPK。NaIO3处理APRE-19，MTT检测细胞活性，WB检测caspase3和LC3A/B,CHOP,XBP1。结论：GSK-3参与神经节细胞凋亡，其抑制剂氯化锂对神经节细胞有保护作用；SHH信号通路对糖尿病视网膜神经节细胞的保护作用可能通过PI3K和ERK1/2通路影响Müller细胞功能达到的。高浓度金诺芬导致内皮细胞凋亡，低浓度金诺芬降低VEGFR3的表达，抑制SVEC细胞增殖、迁移和管腔形成。mini -αA 可以抑制由NaIO3诱导的 RPER细胞凋亡，可以保护由 NaIO3诱导的小鼠视网膜变性，具有潜在临床应用价值。