凡纳滨对虾低温适应机制的研究

Temperature is an unmanageable environmental factor and the change of temperature cause losses to shrimp aquaculture. In an attempt to overcome the above situation, this project, based on the knowledge of physiological and biochemical responses of Litopenaeus vannamei in low temperature challenge, plan to study the molecular regulation mechanism of Litopenaeus vannamei in low temperature adaptation in depth. Using a new generation of high throughput sequencing technologies, the difference of expression profile of mRNAs and miRNAs in Litopenaeus vannamei pre and post low temperature challenge will be analyzed, series of genes and miRNAs associated with low temperature resistance will be explored, the relationship between miRNAs and corresponding target gen and their function in low temperature adaptation of shrimp will be predicted and further verified, so then the gene network played a vital regulatory role of shrimp during low temperature challenge will be constructed, the molecular regulation mechanism of Litopenaeus vannamei in low temperature adaptation will be explained, certain theoretical basis for the regulation of shrimp aquaculture environment and it’s early detection and prevention of low temperature injury will be provided. Furthermore, products of key genes for cold resistance will be expressed efficiently by Pichia expression system, genetic engineering products will be developed and applied to aquatic feeds, these will be aimed to elevate the ability and prolong the time of low temperature tolerance and enhance cold resistance fundamentally for shrimp.

为了尝试克服温度这一不可操纵的环境因子的变动给虾类养殖造成的损失，本项目计划在了解凡纳滨对虾对低温胁迫的生理生化响应的基础上，深入研究凡纳滨对虾低温抗逆的分子调控机制。利用新一代高通量测序技术，分析凡纳滨对虾低温胁迫前后mRNAs和miRNAs的表达谱差异，挖掘一系列与抗低温相关的基因和miRNAs，预测并验证miRNA及其靶基因的调控关系和在虾类低温适应性中的作用，从而构建凡纳滨对虾在低温胁迫过程中具有重要调控作用的基因调控网络，阐述凡纳滨对虾低温适应的分子机制，为虾类养殖环境的调控及低温损伤的早期检测和预防提供一定的理论依据。此外，在实际应用方面，我们将利用毕赤酵母表达体系高效表达抗寒关键基因的产物，研制基因工程产品用于水产饲料，以期提高虾类耐受低温的能力。

为了探究凡纳滨对虾对急性降温的耐受性，项目组首先从活性氧介导的细胞损伤与修复两方面探讨了凡纳滨对虾对低温胁迫的生理生化响应及其调节机制。研究发现，水温的急剧降低会引发对虾出现氧化应激反应，血细胞内活性氧物质增多、钙离子浓度升高、血细胞DNA和肝胰腺结构出现损伤、血细胞总数降低及组成的改变、细胞自噬发生以及细胞凋亡的增加等一系列氧化伤害导致对虾大量死亡。为了维持机体氧化还原平衡和适应性内平衡的稳态，凡纳滨对虾通过调节抗氧化系统（上调相关抗氧化酶和HSP70的mRNA表达）缓解氧化应激，减轻或抵御低温胁迫对机体造成的伤害。. 在此基础上，项目组分析了凡纳滨对虾低温胁迫前后mRNAs 和miRNAs 的表达谱差异，探讨了差异表达基因（TOR、p70S6K、NLK、Smad3、Rheb、UCP4、JNK）所参与的信号途径在对虾响应低温胁迫过程中的变化，以及候选miRNA及其靶基因所在信号通路在低温胁迫中的调控作用。研究表明，低温胁迫下，miR-151通过TOR途径调控细胞自噬与凋亡进而影响凡纳滨对虾的耐受性，miR-122通过调控JNK途径缓解凡纳滨对虾低温诱导的凋亡。. 综合上面的研究，项目组认为凡纳滨对虾在遭受低温胁迫时，机体可通过产生自噬来保护细胞免受氧化应激的伤害，并初步勾勒出低温胁迫下凡纳滨对虾通过ROS介导的JNK/Rheb/TOR信号途径调节细胞自噬与凋亡的作用模式图，为ROS与自噬的研究提供了一种新的调控机制。. 实际应用方面，项目组利用毕赤酵母对凡纳滨对虾的JNK基因进行了真核表达，并将活性较高的重组蛋白作为饲料添加剂混合到对虾饲料中，投喂凡纳滨对虾。养殖结果初步显示，毕赤酵母高效表达的JNK蛋白能够提高低温下对虾的存活率，为进一步研究开发新型的对虾饲料添加剂提供了技术支撑。. 总之，项目的完成有助于拓宽对凡纳滨对虾抗逆机制的理解，为深入研究对虾的低温适应性机制提供了新的证据。